标签: α-病毒 载体 基因转移 第二十七章
α病毒强烈的嗜神经元特性,使其在神经生物学研究中特别有用。但不幸的是,α病毒对宿主细胞强烈的细胞毒性作用、相对短期的瞬时表士模式'以及相当高的病毒产物消耗,都是其缺点。然而,新的突变α病毒显示出了低毒性及长期表达的优点。尤其是高产量的膜蛋白(通常在重组系统中很难有较高水平的表达)有益于在结构生物学上的应用。《病毒也可以用于疫苗开发和基因治疗。 作者:T.弗里德曼等,译者:殷勤伟等,本实验来自「基因转移」
0 收藏 0 阅读
实验步骤 |
重 组 Ct 病毒载体的制备材料 试剂 Aprotinin (10 mg/ml) 仓鼠幼鼠的肾细胞(B H K -21) 使 用 B H K -21 黏附细胞培养物制备重组 S F V 和 S I N 颗 粒 ,用 B H K -21 悬浮细胞大量制备蛋白质产物。中 国 仓 鼠卵巢细胞(C H O K l ) 和 人 胚 胎 肾 细 胞(H E K 2 9 3 ) 可用于表达研究。 帽 类 似 物(m 7 G [5’] PPP [ 5’ G ) cr 胰凝乳蛋白酶, 20m g / m l 完全 B H K 培养基 将 Dulbecco’s modified F-12 培养基和 Iscove’s modified 培养基 I : 1 混合后,加上 4 m m o l / L 谷 氨 酸 盐 和 1 0 % 胎 牛 血 清(F C S )。 D TT, 50 mmol/L D M R IE -C (Invitrogen) 乙 醇(7 0 % 和 9 5 % , V / V ) O pti-M E M I 低 血 清 培 养 基 苯 酸 :氯 仿 :异 戊 醇(25 : 24 : 1 , V / V / V ) 质粒 p SIN R ep 5 (Invitrogen) pSIN rep504 S I N 辅 助 载 体 D H -B B S IN 辅 助 载 体 D H -B B ( 2 6S) 5’ S IN (Invitrogen) 所 有 S I N 和 S IN S 助 载 体 都 需 经 过 酶 切 线 性 化 。 p S F V l ( S 扣 I 线 性 化) p S F V 2 g e n (JVrwI 线 性 化) p SFV -h elp er2 载体 p SF V -h elp erS2 p S F V -h e lp e rC S 2 19 A 将所有 S F V 载 体 用 I 线性化。 P B S 限 制 性 内 切 核 酸 酶 : JVoZ I 、 JV ra I 、 _Pac I 、 S a p I 、 S f e I 、 _X7io I R N A 酶 抑 制 物(1 0 〜 5 0 U /ul ) r N T P 混 合 物 10 m m o l/L rA T P 10 m m o l/L rC T P 10 m m o l/L rU T P 5m m o l/L rG T P IO X S P 6 缓 冲 液 400m m ol/L H E P E S (p H 7. 4) 6 0 m m o l/L 乙酸镁 2 0 m m o l/L 亚 精 胺 1 5 X S P 6 缓 冲 液 SP6 R N A 聚 合 酶(1 0 〜 20U/uD 胰 酶 -E D T A 〇 . 2 5 % 胰 酶 lm m o l/L E D T A 无 R N A 酶水 仪器 细 胞 培 养 板(6 孔 、 1 2 孔 和 2 4 孔) 电 穿 孔 管(〇 • 2 c m 和 0. 4 cm ) 电 穿 孔 仪(B ioR ad G ene P u lser) 18•加人 aprotinin 至终浓度为 250 ug/ml以终止反应。
|
---|
实验步骤 |
纯化方法材料试剂 吸收缓冲液 10m m o l /L 憐酸缓冲液(p H 7. 5) 10m m o l / L Na C l 亲和色谱树脂(M a t r e x Cellufine Sulfate, Millipore) 洗脱缓冲液(1〜2m o l /L N a C l 或 K C 1 蔗 糖(2 0 % 或 5 0% ttz/V 水稀释) T N E 缓冲液 100m m o l / L Na C l 0.l m m o l / L E D T A 仪器 离心机 离心浓缩器(Millipore) 超离心管 超离心转子 S W 40 T i 、 S W 41 T i 或 S W 28 方法 1.制 备(如果需要,激活)病毒储存液(方 案 1)。 2•纯化和浓缩病毒储存液。 蔗糖梯度超离心 a. 吸 取 Iml 5 0 % 蔗糖溶液至超离心管中。 b . 小心的加入一层 3m l 2 0 % 蔗糖,建立梯度。 c. 将病毒储存液(S W 40 T i 管需要 8m l , S W 40 T i 管需要 9m l ) 缓慢加在梯度蔗糖溶液上面。 d. 4 °C , 16 OOOg 离心 90m in。 病 毒 带 在 2 0 % 蔗 糖 和 5 0 % 蔗糖交界面附近。 e. 移去培养基部分和底部的 0.8m l (50% 蔗糖)收集病毒。 另外一种替代方法是,可以利用 2 0 % 蔗糖垫来沉淀病毒。用 SW2 8 转 子 4℃, 25 000r/m in离 心 2 h , 然 后 用 400ulT N E 缓冲液重悬病毒沉淀。 离心浓缩 可以用离心浓缩仪来快速而简单的浓缩病毒储存液。 a. 根据厂商说明将病毒样品加入离心浓缩仪的样品槽中。 b•根据厂商推荐的速度离心直至液体在滤液收集槽的内部和外侧都平衡。 c. 将离心浓缩仪取下,然后揭开密封盖,弃去滤液。 d. 盖上盖子再次离心。 e•弃去滤液,取下离心浓缩仪。 f. 收集浓缩的病毒。 如果需要更高的病毒浓度,可以再次离心。 亲和色谱浓缩 亲和色谱可以除去内毒素和其他污染物同时 10 倍浓缩病毒。 a•根据厂商说明用 M atrex Cellufine su lfa te 树脂装填亲和色谱柱。 b. 用数倍树脂床体积的吸收缓冲液平衡柱子。 c•在 p H 7. 5 条件下上样病毒样品。 d. 用数倍树脂床体积的吸收缓冲液洗涤柱子以除去非结合性的污染物。 e. 用洗脱缓冲液洗脱病毒。 f. 收集多个组分。通过实验感染确定病毒浓度峰值来确定组分。
|
---|
实验步骤 |
病毒滴度的确定材料试剂 抗体 一 抗(抗靶抗原的特异抗体) 荧光素偶联的二抗(一抗特异性的) B H K - 2 1 细胞 根据研究,可以使用其他类型的细胞。 封闭缓冲液:含有〇.5 % 明胶海绵和 0•2 5 % 牛血清白蛋白的 P B S 完全培养基 针对使用的细胞类型选择。 D A B C O 甲醇 M g C l 2 (l m o l /L ) 室温保存。 Moviol 4-88 磷 酸 盐 缓 冲 液(P B S ) 铁 氰 化 钾(50m m o l /L ) 4°C 保 存 。 亚 铁 氰 化 钾(50m m o l /L ) 4°C 保 存 。 溶 于 DMF 或 DMSO 的 X-gal ( 2 % ) —2 〇°C 保 存 。 病毒储存液 按 照 方 案 1 制备的可表达 G F P 、β半乳糖苷酶或其他目的抗原的重组 a 病毒。 仪器 细胞培养板(6 孔 或 12 孔) 盖玻片 荧光显微镜 玻片 方法 基因表达的显示 1.将目的细胞系接种至 6 孔 或 12 孔细胞板上或盖玻片上。将细胞培养至一定的浓度。 2•用梯度稀释的可表达报道基因或目的抗原的病毒储存液感染细胞。 3.37°C 培养细胞过夜。 4 . 转染后 4 8 h 内确定滴度。 在早期的时间点,信号可能未达到最佳,一些突变的载体尤其是这样。在后期的时间点,细胞病变效应逐渐使细胞脱落。 通过检测 G F P 确定滴度 a. 用荧光显微镜检查细胞培养孔或盖玻片。 X-gal 染色确定滴度 a. 制备新鲜的 X -gal 染色溶液,将各种储存液稀释到 P B S 中至终浓度含 5m m o l / L铁氰化钾、 5m m o l / L 亚铁氰化钾、 2m m o l / L M g C l 2 和 l m g / m l X -gal。 b . 用 P B S 洗涤细胞。 c•用冷甲醇一 20°C 固定细胞 5m i n 。 d. 用 P B S 洗涤细胞三次。 e’. 室温或 37°C 用 X -gal 染色溶液染色细胞至少 2 h 。 f. 计 数 X -g a l 阳性细胞。 通过免疫荧光确定滴度 a•用 P B S 洗涤盖玻片两次。 b•用冷甲醇一 20°C 固定细胞 6 min。 c. 用 PBS 洗涤盖玻片 3 次。 d•室温下用封闭缓冲液孵育 30 min 以封闭非特异性的结 合 。 e•用一抗代替封闭缓冲液,室温下孵育 30 min。 f . 用 PBS 洗涤盖玻片 3 次。二抗室温孵育 30 min。 g•用 PBS 洗涤盖玻片 3 次,用水洗漆一次,空气中晾干盖玻片。 h. 将盖玻片在玻片上用 IOmI 含 2. 5 % DABCO 的 Moviol 4-88 封片 i . 用荧光显微镜观察。计数阳性细胞。 5•将阳性细胞数与稀释倍数相乘,将滴度表示为感染颗粒数/m l。
|
---|
实验步骤 |
培养细胞系中基因表达的评估材料试剂 冰乙酸 Amplify (Amersham) 抗体 一 抗(针对目的抗原) 二 抗(针对一抗) 目 的 细 胞 系 .• B H K - 2 1、 C H O K l 、 H E K 293 C h a s e 培养基:添 加 2 m m o l/ L 谷氨酰胺、 20 m m ol/L H E P E S 和 15ug/m l 未标记蛋氨酸的 M E M 培养基 E C L 化学发光试剂盒(A m e r s h a m ) 裂解缓冲液 50m m ol/L T ris-H C l (p H 7. 6) 15 0 m m o l/L N aC l 2m m o l/L E D T A 1% (V fV s) N onidet P-40 (Sigm a-A ld rich ) 甲醇 [ 35S ] 蛋 氨 酸 牛奶 磷 酸 盐 缓 冲 液(P B S ) 聚 丙 烯 酰 胺 SD S 饥 饿 培 养 基 :添 加 2m m o l / L 谷 氣 醜 胺 和 20m m o l / L H E P E S 的 无 蛋 氨 酸 的 M E M 培 养 基 T r i s 盐 缓 冲 液(T B S ) Tw een-20 病 毒 储 存 液 根据方案 1 制备的表达目的基因的重组α病毒。 仪 器 细胞培养板(6 孔、 12 孔 和 24 孔) H y b o n d E C L 尼龙膜滤器(A m e r s h a m ) Hyperfilm-MP 放射性强度探测器 S D S —— P A G E 设备 蛋白质印迹设备 方法 2.分析基因表达。 蛋白质印迹 a. 在感染后不同的时间点,每 个 6 孔 板 孔 中 加 入 250^x1 裂解缓冲液,冰上放置 l Omin。 b. 重悬细胞。 c. 上样样品,然后在正常标准下 1 0 % 〜12% S D S 聚丙烯酰胺凝胶电泳。 d. 将蛋白质转到尼龙膜上。 e. 4°C 下,将尼龙膜放在含 5% 牛奶和〇.1 % T w e e n -20 的 T B S 中孵育 30m i n 。 f. 室温下将尼龙膜放在一抗中孵育 30m i n 。 g. 室温下将尼龙膜放在二抗中孵育 30m i n 。 h. 根据厂商说明,用 E C L 化学发光试剂盒显示特异的蛋白质带。 代谢标记 a. 弃去细胞的培养基并用 P B S 洗潘一次。 _ b. 加人饥饿培养基, 37°C 孵 育 30m i n C . 用 含 5 0 〜lOOuCi/m l 的 [35S] 蛋氨酸的饥饿培养基替代饥饿培养基。 d. 37°C 孵育 20m in。 e. 弃去培养基并用 P B S 洗涤一次。 f•加人 chase 培养基,孵 育 15 min〜3 h 。 g. 弃 去 chase 培养基,用 P B S 洗涤一次。 h•每个 6 孔板的孔中加人 250ul 裂解缓冲液,冰上放置 lOmin。 i- 重悬细胞。 j•上样样品,然后在正常标准下 1 0 % 〜1 2% S D S 聚丙烯酰胺凝胶电泳。 k •室温下用 1 0 % 冰乙酸/ 3 0 % 甲醇固定凝胶 30m i n 。 1•用 A m p lify 替换固定溶液。室温下孵育 30m i n 。 m . 将凝胶晾干,进行放射活性鉴定并将凝胶放在 H y p e r f i l m - M P 中 2〜24 h 。 n•做 X 光片并观察放射性带。 原代细胞的感染 a•从 E 17 期胚胎中分离原代大鼠海马区神经元。 b•用添加了 1 0 % 马血清的 D M E M 培养基培养细胞。 c•往原代细胞中直接加入合适的病毒浓缩液。 d. 防止对细胞的多余操作。 e. 做时间点测试,以确定最佳的表达条件。
|
---|
实验步骤 |
向海马区切片的组织培养物传递病毒材料试剂 C u ttin g 培养基 1 0 m m o l/L M gC l2 0.5/umol/L 河肠毒素 大鼠海马区切片培养物 根据滚筒管配置制备大鼠海马区的组织型切片培养物。 病毒储存液 根 据 方 案 1 制备可表达目的基因的重组 a 病毒。 仪器 显微操纵器 微吸管 使用前灭菌。 方法 1.用 cutting 培养基将病毒储存液 10〜1000 倍稀释,使之可以区分单个的神经元。 2.用消毒过的吸头吸取 20〜30W 病毒稀释液,用显微操纵器将病毒稀释液注射进入组织切片的椎体细胞层和粒细胞层。 3.将吸头移到邻近的区域,每个切片重复注射 1 〇〜15 次。 4 将切片放在培养基中孵育 10〜60s 以除去河豚毒素和其他残留的病毒颗粒。 5•将切片培养物孵育 1〜3d ,进行表达分析。
|
---|
实验步骤 |
啮齿动物体内的病毒投递材料试剂 动物:大鼠或小鼠 B H K - 2 1 细胞 克他命 病毒储存液 根 据 方 案 1 制备可表达目的基因的重组 a 病 毒 ,使用前需要用〇 • 22 um 滤器过滤灭菌。 X ylazine 仪器 滤器•(无菌, 0.22um,微孔) H am ilton 注 射 器(10/m1) 注 射 器(不锈钢) 微型输液泵 聚乙烯管 定向设备 方法 在全身麻醉并伴有体温调节控制及氧气补充的情况下进行微注射。 1 . 用方案 3 确定病毒储存液在 B H K - 2 1 细胞中的大概滴度。 2 . 稀释病毒,使之适用于实验条件。 对纹状体、扁桃体或脑皮层,使用 IO5个病毒颗粒;对脑室,使用 IO7 个病毒颗粒。 3 . 通过每千克体重腹膜内注射 2 0 0 m g 克他命和 IOmg x y la zin e 来麻醉实验动物。 4 . 根据动物调整定向设备。 5.用不锈钢注射器吸取病毒,通过聚乙烯管连接微型输液栗和 IOul H am ilton syrin g e。 6 . 以 0. 5ul/m i n 的速度融合病毒溶液。 7.将针在原位多放置 2m i n 。 8.将针缓慢的拿开。 9•缝合伤口,手术后 3〜4 h 内使动物处于温暖的环境下。 10•简单的健康检测(如体重、体温和食量等)和行为反应。 11.在注射后的不同时间点,收集组织和鉴定转基因的表达
|
---|
更有优质直播、研选好物、福利活动等你来!
本网站所有注明“来源:丁香园”的文字、图片和音视频资料,版权均属于丁香园所有,非经授权,任何媒体、网站或个人不得转载,授权转载时须注明“来源:丁香园”。本网所有转载文章系出于传递更多信息之目的,且明确注明来源和作者,不希望被转载的媒体或个人可与我们联系,我们将立即进行删除处理。
我的询价