标签: RNA 干扰 基因沉默 转录
RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。目前主要用于(1)特异性剔除或关闭特定基因的表达(2)探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗(3)使用RNAi技术来病毒进入人体细胞
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2. RNAi具有的特征
①RNAi是转录后水平的基因沉默机制;
②RNAi具有很高的特异性,只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA;
③RNAi抑制基因表达具有很高的效率,表型可以达到缺失突变体表型的程度,而且相对很少量的dsRNA分子(数量远远少于内源mRNA的数量)就能完全抑制相应基因的表达,是以催化放大的方式进行的;
④RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限,在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点;
⑤dsRNA不得短于21个碱基,并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21 bp左右的siRNA,并由siRNA来介导mRNA切割。而且大于30 bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰,而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡;
⑥ATP依赖性:在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能是Dicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量。
3. 也有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默。
提高siRNA和表达载体转染效率的方法:
1. siRNA必须纯化:在转染前要确认siRNA的大小和纯度,为得到高纯度的siRNA,推荐用玻璃纤维结合,洗脱或通过l5%-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸、小的寡核苷酸、蛋白质和盐离子。尤其是化学合成的RNA通常需要PAGE胶纯化。
2. 避免RNA酶污染:即使微量的RNA酶也会导致实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在,因此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。
3. 健康的细胞培养物和严格的操作:通常健康的细胞转染效率较高。此外,较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验,推荐用50代以下的转染细胞,否则细胞转染效率会随时间明显下降。
4. 通过合适的阳性对照优化转染和检测条件:将不同浓度阳性对照的siRNA转入靶细胞,转染48h后统计对照蛋白质或mRNA相对于未转染细胞的降低水平,过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。
siRNA转染后目的蛋白没有减低是为什么?
我想用siRNA抑制DMT1,在吉马公司买了三个siRNA,我用的是lipo2000转染,转染前饥饿2h,转染6小时,后换成完全培养基48小时,对照使用转染GAPDH做的,接下来WB检测DMT1,却没有观察到目的蛋白的下降,请问有人遇到过相似的情况吗?应该怎么解决。
3 评论
基因沉默设计几条序列?
各位老师,本人初次接触基因沉默,请问至少需要设计几条序列来验证?最后做的时候是用效率最高的那条吗?
胚胎RNA干扰
大概需要维持7-9天,用shRNA还是慢病毒?大概什么时期注射?
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