标签: 肽 MAP 精编免疫学实验指南 第十三章
介绍了如何选择一条合成肽用以制备识别完整蛋白的抗血清:包括如何选择合适的多肽用来免疫,如何将多肽结合至载体蛋白及设计合成多价抗原肽阐述了针对抗原肽的抗血清的制备方法,同时介绍了免疫接种流程、ELISA法测定抗体滴度及亲和层析法纯化能够与抗体特异结合的多肽的方法。 作者:J.E.科利根等,译者:曹雪涛等,本实验来自「精编免疫学实验指南」
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家兔
肽-载体的连接体(单 元 13. 1)
P B S , p H 7. 5
弗 氏 完 全 佐 剂(F C A ; Pierce Biotechnology)
弗氏不完全佐剂
1 . 收 集 血 样(如从耳动脉或耳静脉),每只家兔准备 2〜5m l 免 疫 前 的 血 清(单 元 1.2)。至少准备 2 只家兔,以防一只家兔死亡或者免疫接种失败。
2 . 将 0.7〜L O m g 的肽-载体的连接体溶于 I m l 的 P B S , 并 加 入 Iml F C A 彻底混溶。每只 家 兔 免 疫 接 种 I m l 这 种 稳 定 的 乳 浊 液 ,在 皮 下 多 个 位 点 接 种 ,每 个 位 点 0.1〜 0•2 ml (单元 1. 2 ) 。
3.2〜6 周 后(或检测到免疫反应减弱时较理想;见基本方案 2),准备一份新的乳浊制剂追加剂量,使用相同的连接体但添加的是弗氏不完全佐剂。如上所述在皮下多个位点接种。若免疫原的量有限,则使用初次免疫接种量的 1/4。
4 . 在加强免疫后 3 周取家兔血样,在 4 周后再次取血获取抗肽的血清。检测免疫反应(见基本方案 2)。
5 . 可选 :若 5〜6 周后免疫反应依然较低,在 10〜1 2 周再次加强免疫一次。并在最后一次接种后 3〜4 周后再次取血。不要第三次加强免疫。
6 . 在免疫反应最强的时候在动物身体许可的范围内取尽可能多的血样。对有免疫反应的兔子在合适的时间取血,这取决于对抗血清质量的要求或已获得了足够多的抗血清 。将血清储存在一 70°C 。
7 . 可 选 :通过免疫亲和层析法,将 抗 血 清 中 不 需 要 的 成 分(如抗载体的抗体)去掉以纯化抗肽的抗体。
这种检测方法能从长度大于 1 5 个氨基酸的肽中筛选出抗血清。对于较短的肽链,
肽或蛋白质抗原
目的抗原的单克隆抗体(M A b )
1 % (m/V) BS A / P B S (见附录 1PBS)
六 肽 的 PS-SCL ( 表 13. 3.1): 5 m g / m l 的 1 2 0 肽 混 合 物(若 需 详 细 资 料 ,联系C. Pinilla9 cpinilla@tpims.org)
辣 根 过 氧 化 物 酶( H R P ) 偶 联 M A b 的 同 种 型 抗 体 的 特 异 性 的 抗 鼠 抗 体(Calbioc h e m ; 按生产商提供的说明书使用)
显影液
4mol/L 硫酸
结合能力较强的聚苯乙烯 9 6 孔 微 量 滴 定 板(如 A / 2 板 , Costar; Immunolon 4 板 ,Dynatech)
保湿盒:用湿纸巾密封的 Tupperware 盒
带 有 4 9 2 n m 滤光片的 9 6 孔微量滴定板读板仪(酶联仪)
1 . 通过抗原-抗体结合的直接和竞争性 E L I S A (见辅助方案)选择最佳的抗原和单抗浓度用于筛选检测。
2 . 加 入 50^1/孔的优化浓度的肽或蛋白质抗原包被 9 6 孔板。每种肽复合物做 2 个复孔。若 每 板 有 8 0 个 样 孔(图 13. 3 . 1 ) 则 准 备 三 个 板 检 测 P S - S C L 的 120 肽复合物。在37°C 下的保湿盒中孵育 2 h 或在室温条件下放置过夜 (18 h )。
3 .翻转滴定板并弃去液体,用水清洗滴定板 1 0 次 。将滴定板在纸巾上拍击以除去残留
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