实验步骤 |
基 本 方 案 可 溶 性 或 膜 结 合 抗 原 的 分 离材 料抗 体(Ab)-Sepharose (单兀 12. 2) 活 化 的(对照)Sepharose填料,用于制 备 A b -Sepharose填 料(单 元 12. 2),但去除了抗体或偶联时用无关抗体替代 细胞或匀浆的组织 T S A 溶液,冰预冷 裂解缓冲液,冰预冷 5 % (m /V ) 脱 氧 胆 酸 钠(Na-D O C ,过滤除菌并室温保存) 洗涤缓冲液 VTris/Triton/NaCl 缓冲液, p H 8.0 和 p H 9.0,冰预冷 lmol/L Tris • Cl, p H 6. 7 ,冰预冷 层析柱储存液,用冰预冷 层析柱 超速离心机 quick-seal 离 心 管(Beckman) 注 :包含抗原的所有步骤都必须在4°C 冷室或冰浴中进行。 1.制备一个A b -Sepharose亲 和 层 析 柱(如 5m l ; 每 毫 升 Sepharose填 料 可 结 合 5m g 抗体)和 一 个 活 化 的(对照)Sepharose预 柱(如 5m l 的装载柱体积偶联或不偶联无关的抗体),并将它们串联起来(图 12. 1.1)。为了流速最大化,最好使用比较粗的层 2 . 将 50 g 细胞冰预冷T S A 溶液悬浮成浓度为I X l O 8〜5 X 1087个细胞/m l 的悬液,或每一收集细胞或勻浆的组织体积加入1〜5 倍体积的冰预冷的 T S A 溶 液 。并加入等体 对于糖基磷脂酰肌醇(GPI) 锚定蛋白质,在 20°C赙 育 IOmin可利于蛋白质的有效溶解。 3.4°C , 4000 g 离 心 IOmin去除核酸,倒出上清液并保存。 4 . 对于纯化膜抗原,加 入 0.2倍 体 积 的 5 % Na-D O C 至去除核酸的上清液中, 4°C 或冰浴 IOmin后 ,转移至quick-seal离心管, 4°C , 100 OOOg离 心 lh,小心取出上清液保存备用。 5 . 将 Sepharose预柱与亲和层析柱连接好(图 12. 1.1)利用下列溶液清洗这两个层析柱: 1 0 柱 体 积(column volume, C V ) 洗涤缓冲液 5CVTris/Triton/NaCl 缓冲液, p H 8.0 5C V T H S/Triton/NaCl 缓冲液, p H 9.0 5C V 三乙醇胺溶液 5C V 洗涤缓冲液。 6 . 将 步 骤 3 或 步 骤 4 的 上 清 液 上 样 到 预 柱(保留部分样品用于下述步骤1 2 的分析),并 以 5C V / h 的流速流经两个层析柱。每 1/10〜1/100上样体积时,收集流穿组分。流速可通过静水压力调节,最大可达到250 cm/h (图 12. 1,1)。通常上样两天对层析柱没影响,但如果上样持续时间较长,则表明层析柱阻塞或裂解液黏性太大, 7 . 用 5C V 洗涤缓冲液清洗层析柱,然后关闭两个层析柱的开关,将预柱与亲和层析柱连接拆开。打开亲和层析柱的开关,使得层析柱顶端的液体排出柱体,保留柱子清洗时的所有组分。 8 . 每次变换缓冲液时要按下述步骤清洗免疫亲和层析柱(步 骤 9〜11)。关闭层析柱的开关,打开层析柱底部的螺帽。将一注射器与缓冲液槽出口端的管道相连,抽吸出管道中的缓冲液,将管子置于另一缓冲液槽,用注射器抽吸,使得管道中充满缓冲液 ,然后移去注射器。将管子弯曲折叠从而调控流速,并用缓冲液清洗层析柱的内壁 。打开层析柱开关,使得缓冲液流入层析柱。将底部螺帽松松地扣在层析柱上,使得缓冲液流经层析柱几厘米后,旋紧螺帽,开始清洗或洗脱。 9 . 用 5C V 的洗涤缓冲液清洗层析柱,先 是 Tris/Triton/N a C l 缓冲液, p H 8 . 0 , 然后是Tris/Trkon/N a C l 缓冲液, p H 9.0。检测最后一次清洗的组分,从而确定非特异性结合或从一些单克隆抗体上解离的蛋白质的洗脱状况。 10.用 5C V 三乙醇胺溶液洗脱抗原,收集洗脱组分,并 将 1 体积洗脱液放入0.2体积的lmol/L Tris • C U p H 6. 7 溶液中。 理想的三乙醇胺溶液的p H 可 使 得 配 体 完 全 解 离(无活性损失),这可通过用SDS——P A G E 分 析 20ul洗脱后的层析柱填料(Ab-Sepharose) 和 50^1洗脱液得以确证。 11.用 5C V T S A 溶液清洗层析柱。为了避免层析柱干掉,用 T S A 溶 液 4°C 保存层析柱以备用。 12.利 用 S D S - P A G E (单元12. 3 ) 和 银 染(单 元 12. 4 ) 分析每一 50M1洗脱组分是否含有抗原。通 过 A b -Sepharose利用免疫沉淀法分析(X 5〜I m l 样品和代表性的流穿及洗涤组分,然后再进行SDS-P A G E 和银染从而确定层析柱是否饱和。 如果洗脱过程中,抗体从填料上脱落,利 用 protein A -Sepharose可去除洗脱液中 的 抗 体(Ey M a L , 1978)。即使是结合力较弱的小鼠I g G l 亚群在p H 8 的条件下也 能 去 除 掉(M . Dustin, pers. C o m m .) 当利用辛烷基P-D -葡糖苷或脱氧胆酸钠作为去垢剂时,可测定A 28。值对各组分进行初步分析。 备 选 方 案 1 抗 原 低 pH 洗脱附 加 材 料磷酸钠缓冲液, p H 6. 3 甘氨酸缓冲液 lmol/L Tris • Cl, p H 9. 0 1 . 制备层析柱和裂解液,清 洗 层 析 柱 并 分 离 抗 原(见 基 本 方 案 步 骤 1〜 9 , 用 Tris/Triton/N a C l 缓冲液、 p H 8. 0 彻底清洗层析柱)。进行酸洗脱之前需去除脱氧胆酸钠,因为脱氧胆酸钠在低p H 过 渡 到 中 性 p H时,会形成沉淀或胶体。 2 . 用 5C V 的磷酸钠缓冲液、 p H 6. 3 清洗层析柱。 3 . 用 5C V 的 甘 氨 酸 缓 冲 液 洗 脱 抗 原 。将 洗 脱 组 分 收 集 到 含 0 . 2 倍 体 积 的 lmol/LTris • C U p H 9.0溶液的试管中,收集后立即混匀每一组分。 4 . 分析各组分是否含有抗原(见基本方案,步 骤 12)。 备 选 方 案 2 用 辛 烷 基 P-D-葡糖苷洗脱抗原附 加 材 料(其他材料见基本方案)辛烷基β-D -葡糖苷 1 . 制备层析柱和裂解液,清 洗 层 析 柱 并 分 离 抗 原(见 基 本 方 案 步 骤 1〜 9 , 用 Tris/Triton/N a C l 缓冲液, p H 8. 0 彻底清洗层析柱)。 2 . 用 5C V 含 1 % 辛烷基β-D-葡糖苷的T S A 溶液洗涤层析柱。 3.用 5C V 含 0 •l%Triton X -IOO 替 代 1 % 辛 烷 基 β-D -葡糖苷的三乙醇胺溶液洗脱抗原。 4 . 收 集 I C V 的洗脱液至含有 0 •2C V lmol/L Tris • C U PH 6. 7 的试管中。 5 . 清洗层析柱并分析各组分(见基本方案,步 骤 11〜12)。
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实验步骤 |
基 本 方 案 1 用非变性去垢剂裂解细胞制成的悬液进行免疫沉淀材 料未标记或标记的细胞悬液 P B S ,冰预冷 非变性裂解缓冲液,冰预冷 5 0 % (V A O protein A-Sepharose 填 料(Sigma, Amersham Pharmacia Biotech)保存于含 0.1% (m /V ) B S A 和 0,01% (m /V ) 叠 氮 钠(N a N 3) 的 PBS 溶液中 特异性的多克隆抗体(抗血清或亲和层析纯化的免疫球蛋白)或 单 克 隆 抗 体(腹水 、细胞培养上清或纯化的免疫球蛋白) 特异性抗体的对照抗体(如免疫前血清或制备特异性多克隆抗体纯化的无关免疫球蛋白、无关腹水、杂交瘤培养上清或制备特异性单克隆抗体纯化的无关免疫球蛋白) 10 % (m /V ) B S A 洗涤缓冲液,冰预冷 转子角度固定的微量离心机(Eppendorf 5415C 或相似类型) 试 管 旋 转 器(能够来回颠倒) 连接真空抽滤装置的巴氏吸管 1.将细胞悬液(0.5X 107〜2 X 107 个 细 胞 获 得 I m l 裂解液)放 入 一 个 15m l 或 50m l 带螺帽的锥底离心管中 4°C , 400 g 离 心 5 min。将试管置于冰上,用连接真空抽滤装置的巴氏吸管吸出上清液。 2 . 轻拍试管底部重悬细胞。冰 预 冷 P B S 如 步 骤 1 所述清洗细胞两次,所 用 P B S 的体积与原先的细胞培养体积相同。 3 . 加 入 I m l 冰预冷的裂解缓冲液至 0.5X 107〜2 X 107个细胞,用中等速度旋转混合器轻 轻 旋 转 试 管 3s,重 悬 细 胞 沉 淀 。将 细 胞 悬 液 冰 浴 15〜 30m i n 后 ,转移至一个1.5m l 锥底微量离心管中。 4°C , 16 OOOg (最大转速)离 心 15m i n 澄清裂解液。为了减少免疫沉淀的背景,如果需要,可将裂解液 10 超速离心 lh。 4 . 用安装了一次性吸头的可调节吸管将上清液转移至一干净的微量离心管中。不要搅动沉淀,并 残 留 20〜40ul 上清液在离心管中。将澄清的裂解液冰浴直到预清除(步
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实验步骤 |
基 本 方 案 1 考马斯亮蓝染色检测范围为〇.3〜lMg 每蛋白质条带。 材 料(带 V 项 目 见 附 录 1)聚丙烯酰胺凝胶(单 元 12. 3) 考马斯亮蓝、银染用固定液 考马斯亮蓝染液 甲醇/乙酸脱色液 7 % (V /V ) 水乙酸 Whatman 3M M 滤 纸(可选) 干 胶 仪(可选) 1 . 将聚丙烯酰胺凝胶放入塑料容器中,加 入 3〜5 倍胶体积的固定液,室温下摇床上振荡 2 h。 2 . 弃去固定液,加入考马斯亮蓝染液振荡 4 h 。 3 . 弃去染色液,用 50m l 左右固定液清洗凝胶。 4 . 弃去固定液,加入甲醇/乙酸脱色液振荡 2 h 。 5 . 弃去脱色液,加入新鲜脱色液继续脱色,直至凝胶背景和条带清晰。可将凝胶储存于 7 % 水乙酸中,或者储存于含水密封塑料袋中, 4°C 可储存一年左右。 6 . 若有需要,可将凝胶拍照。 7 . 若有需要,制成干胶可永久保存凝胶。将凝胶置于两张 Whatman 3M M 滤纸上并用塑料纸覆盖,在 80°C 干胶仪中干燥 1〜2 h 。 基 本 方 案 2 银染材 料聚丙烯酰胺凝胶(单 元 12. 3) 考马斯亮蓝、银染用固定液 甲醇/乙酸脱色液 10% (V /V ) 戊 二 醛 溶 液(从 5 0 % 储存液现配; Kodak) 硝酸银溶液 显色液 K o d a k 快速固定液 A Whatman 3M M 滤 纸(可选) 干 胶 仪(可选) 注 :操作时戴好手套,避免指纹留于凝胶上。 1.将凝胶放入塑料容器中并加入 5 倍胶体积的固定液,室温下摇床上缓慢振荡 30 min以上。 2 . 弃去固定液,加 入 5 倍胶体积的甲醇/乙酸脱色液固定凝胶,缓 慢 振 荡 60m i n 以上。 3 . 弃去脱色液,加 入 5 倍胶体积的 1 0 % 戊二醛溶液,在通风橱中缓慢振荡 30 min。 注意:戴手套并在通风橱中操作。 4 . 弃去戊二醛溶液,用水清洗凝胶 4 次以上,每次水洗时间 30m i n 以上,最好最后一次能清洗过夜。 5 . 弃去洗液,用 5 倍胶体积的硝酸银溶液染色(覆盖胶)15 min,剧烈振荡。 注意:染色后马上弃去硝酸银溶液并用清水冲洗。 6 . 把凝胶放入另一塑料容器中,用去离子水清洗 5 遍 ,每次缓慢振荡 lmin。 7 . 将 25m l 显色液用 500m l 水稀释,把凝胶放入另一容器中,加入足够量显色液剧烈振荡 。显影至目的条带清晰而背景无色,若显色液变成棕色,可更换新鲜显色液。 8 . 将凝胶放入 K o d a k 快速固定液 A 中 5 min,若有需要,可用浸润的棉球擦去凝胶表面残留的银。 9 . 弃去快速固定液,并用清水彻底清洗凝胶(4 或 5 次)。 10.尽快将凝胶拍照。 11.制成干胶可长期保存(见基本方案 1 ,步 骤 7),或者将凝胶储存于密封的塑料袋中(可 保 存 6〜1 2 个月)。 基 本 方 案 3 SYPRO Orange 或 SYPRO Red 荧光染色检测范围为 1〜2n g 每蛋白质条带。 SYPRO Orange 染料推荐使用氩激光扫描器,而 SYPRO Red 染料使用绿 H e -N e 或 N d /Y A G 激光扫描器。这两种染料都需要紫外或宽带照明的激发并在有适当胶情况下,用 C C D 照相系统显色。 材 料VSYPR O Orange 或 SYPRO Red 荧光染液 7.5% (V /v)乙酸 0.1% (V /v) Tween 20 1 . 使 用 SDS-PAGE 电 泳 分 离 蛋 白 质(单 元 12.3),但 电 泳 缓 冲 液 中 S D S 的浓度为0 . 0 5 % ,而非一般情况下的 0 . 1 % 。需 用新鲜配制的 SD S 储存液来配制电泳缓冲液。 2 . 将 SYPRO Omnge 或 SYPRO R ed 荧光染液倒入一个清洗干净的小玻璃皿中。一或两块标准大小的凝胶使用 50m l 左右染色液,大型凝胶则需 500〜750m l 染色液。 对 于 低 浓 度 凝 胶 和 小 分 子 质 量 蛋 白 质 而 言 ,将 染 色 液 的 乙 酸 浓 度 从 7. 5 % 提高到1 0 % ,可 以 使 得 凝 肢 上 蛋 白 质 有 更 好 的 保 持 力 而 不 降 低 灵 敏 度 。 3 . 将凝胶放入染色液中,用铝箔盖住玻璃皿使凝胶避光,或者可将凝胶置于密封的塑料袋中染色,染色液的体积不变。在室温下缓慢振荡 1 〇 〜6 〇 min。 4 . 回收染色液并可重复使用(最 多 4 次)。用 7. 5 % 乙酸彻底冲洗凝胶(< lmin),若有需要,也可将凝胶在染色液中避光过夜。 5 . 将凝胶在 0.1%Tween 2 0 溶液中温育脱色过夜,或者更换数次 7. 5 % 乙酸来脱色。 6 . 将凝胶拍照观察。 基 本 方 案 4 SYPRO Ruby 荧光染色SYPRO Ruby 染料可使糖蛋白、脂蛋白、钙结合蛋白、纤维蛋白和其他难以染色的蛋白质染色,但不影响蛋白质的后续 E d m a n 测序或质谱分析,将凝胶置于塑料支持物上也不影响 SYPRO Ruby 染色。 材 料单向或双向聚丙烯酰胺、 I E F 凝 胶(单 元 12. 3) 双向聚丙烯酰胺凝胶 SYPRO Ruby 染色用固定液 IE F 凝胶固定液: 4 0 % (V A O 甲醇/10% (m /V ) 三氯乙酸 n/ SYPRO Ruby 蛋 白 质 凝 胶 染 色(分子探针) 1 0 % (V /V ) 甲 醇(或乙醇)/ 7 % V /V ) 乙酸 2 % (V /V ) 甘油 旋转摇床 la. 单向聚丙烯酰胺凝胶:直接跳至步骤 2 (无需固定)。 lb. 双 向 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 :将 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 用 适 量 S Y P R O R u b y 染色固定液固定 3 〇 min 乙 醇 和 乙 酸 的 结 合 会 形 成 乙 酸 乙 酯 ,这 是 一 种 毒 性 物 质 ,并 且 会 影 响 蛋 白 质 的质 谱 分 析 。 lc. IE F 凝 胶 :用 4 0 % 甲醇/ 1 0 % 三 氯 乙 酸 溶 液 固 定 3 h 后 ,用 蒸 馏 水 冲 洗 三 遍 ,每遍 IOmin 2 . 将凝胶转移至适当大小的聚丙烯或 P V C 平皿中,加入未经稀释的适量 S Y P R O Ruby蛋白质凝胶染色液,连续温和振荡。如 在 50r/m i n 转速的旋转摇床上,为使蛋白质呈现最大灵敏度,单向或双向凝胶需温育 3 h 以上,而 I E F 凝胶则需温育过夜。 3 . 为了降低背景荧光和增强灵敏度,将凝胶转至干净的染色皿中并用 1 0 % 甲 醇(或乙醇) / 7 % 乙酸溶液清洗 30 min,聚丙烯酰胺凝胶清洗一次即可, I E F 凝胶则需清洗三次。 4 . 可 选(永久保存):将凝胶置于 2 % (v/ V ) 甘油中室 温 下 孵 育 30 min,用干胶仪使染色好的凝胶干燥。 5 . 将凝胶拍照并观察结果。 备 选 方 案 1 聚丙烯酰胺凝胶上磷蛋白的特异性荧光染色检测范围为 1〜16n g 磷蛋白每条带。对于单体磷蛋白而言,信号强度与磷酸基团的数量有关,并与超过三个数量级呈线性关系。 材 料包含目的蛋白的样品 甲醇,质谱级 三氯甲焼,质谱级 I X S D S 样品缓冲液 磷 蛋 白 标 准 品(PeppermintStick 磷蛋白分子质量标准品, Molecular Probes; 也可见表 12. 4.1) 磷蛋白凝胶用固定液 Pro-Q Diamond 麟蛋白凝胶染色液(Molecular Probes) V 磷蛋白凝 胶 脱 色 液(也可购于 Molecular Probes 公司) 聚 苯 乙 烯 染 色 皿(如称重皿) 旋转摇床 2 . 再次离心,弃去浮在表面的物质。用 Speedvac 蒸汽机干燥沉淀物,用 标 准 I X 电泳样品缓冲液重悬沉淀。 3 . 将样品与磷蛋白标准品、磷酸化和非磷酸化对照一起电泳(单 元 12. 3),为了检测到少量磷蛋白,使用和典型考马斯亮蓝染色相近的蛋白质量(见基本方案 1)。 5 a . 将 凝 胶 在 IOOrnl 左右水中温和振荡 10 min,重复清洗一次。 6a.将凝胶置入 50 ml Pro-Q Diamond 磷蛋白凝胶染色液中避光孵育 75〜120 min。 7 a . 在室温下将凝胶置于 80m l 磷蛋白凝胶脱色液中避光孵育 3 h 左右 ,其中更换两次脱色 液(如 赙 育 3 次 ,每 次 60 min)。用适当的仪器将凝胶成像并存档。
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实验方法原理 |
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实验步骤 | 基 本 方 案 1 液体容器中的蛋白质印迹材 料待分析样品 标准分子质量蛋白质,预 染 型(Sigma 或 Bio-Rad) 或 生 物 素 化 型(Vector labs 或Sigma) 转移缓冲液 无粉手套 Scotch-Brite 垫 片(3M ) 或类似海绵 Whatman 3M M 滤纸或类似物 转 移膜:0.45um 硝 酸 纤 维 素 膜(Millipore 或 Schleicher& Schuell), P V D F 膜(Millipore Immobilon P ) ,中 性 尼 龙 膜(Pall Biodyne A ),或者正电荷尼龙膜(Pall Biodyne B ; Bio-Rad Zetabind) 电 印 迹 装 置(E C 装置, Bio-R a d 或 Hoefer) 不可擦拭圆珠笔或软笔芯铅笔 1.准备抗原样品,用小型或标准大小单向或双向凝胶分离蛋白质,上样时将预染的或生物素化的标准分子质量蛋白质上一道或多道。 2.电 泳 结 束 后 ,拆 除 凝 胶 板 去 除 上 层 胶 ,在 室 温 下 用 适 量 转 移 缓 冲 液 将 凝 胶 平衡 30 min。 3 . 准备一个足够大的盘置放塑料转移盒,盘中注满转移缓冲液将盒覆盖。 4 . 按 照 图 12. 5.1 所 示 ,在塑料转移盒的底部一边放置 Scotch-Brite 垫片或海绵,再放上一张用转移缓冲液润湿的与凝胶同样大小的滤纸,在滤纸上放上凝胶,用试管轻轻地在凝胶表面卷动以赶走凝胶和滤纸之间的气泡。 5 . 剪一张两边缘比凝胶宽 1〜2m m 的转移膜,将硝酸纤维素膜和尼龙膜呈 45°角慢慢放 |
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