质体将胶纯化的YAC D N A 引入哺乳动物细胞 附加材料( 见基本方案1 ; 标V 的条目参见附录1) 含带有M O 筛选标记的完整Y A C D N A (支持方案1 ) 的 P F G E 胶 条 ( 基本方案2) V 透析缓冲液I lU/yl 琼 脂 水 解 酶 (N e w England Biolabs) Lipofectin (Life Techologies) 或 其 他 可 用 于 D N A 转 染 的 阳 离 子 脂 质 体 ( 如" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/B14696701495926hjcc3d6uxpng_small.jpg" style="width: 428px; height: 627px;" />
质体转染,对于步骤8 中的G 418,加 人 1〜4/^g/m l 灭瘟素 (使用IOOOX储液) ,最敏感的细胞将在1 周内被杀死。 11. 从抗灭瘟素细胞或转基因小鼠中制备基因组D N A ,用于P C R 和 Southern印迹。 12. 通过P C R 或 Southern印迹确定B A C 中是否存在已知基因或标志,以检测B A C 上 的标志和接受细胞系中的等位基因间的多态性。利用临近载体的分子探针(B A C 中的插人结点)估计拷贝数。 支持方案4 线性化B A C 和胶纯化BAC 材 料 ( 标V 的条目参见附录1) B A C D N A (基本方案2 , 步骤8) JVoi I 或 Asc工限制酶及适当的缓冲液 V 透析液" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/B1469670702105r8tvmrat59png_small.jpg" style="width: 432px; height: 557px;" />