标签: 巨噬细胞 表型 检测 精编免疫学实验指南 第六章
提供一种人单核/巨噬细胞的表型检测方法。 作者:J.E.科利根等,译者:曹雪涛等,本实验来自「精编免疫学实验指南」
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待 测 单 个 核 细 胞(肝素抗凝血或肝素抗凝骨髓)或 外 周 血 单 个 核 细 胞(单 元 8.1)或者单核/巨 噬 细 胞(单 元 8. 5 , 推荐采用阴性分选)
PBS
PBS/肝素:含 0.1% (V/V ) 肝 素 的 PBS
阻 断 IgG,浓 度 3 mg/ml (如正常小鼠 IgG, Caltag)
荧光素标记的单克隆抗体(表 6. 3. 2)
E M A (Ethidium monoazide) 溶液
A C K 裂 解 液(新鲜配制,室温保存应< 1 2 h)
7 2 % (m /V ) 甲醛
12m m X 75m m 试管
15m l 锥 底 塑 料 离 心 管(Falcon)
低 功 率 白 炽 灯(如 40W 白炽灯)
Sorvall R T 6000B 离心机和转子
la. 使用肝素抗凝血或抗凝骨髓时:在 15m l 锥底塑料离心管中加入约 IOml 抗凝血或1〜3ml抗凝骨髓, 4℃, 1500g离心 3min。弃血 浆 ,加入 1 〇ml PBS/肝素,盖紧 巨噬细胞时:用 P B S 调整细胞浓度至2 X 107个细胞/m l 。 2 . 准 备 7 只 12m m X 75m m 试管,将 试 管 1〜7 编号,每 管 加 入 50|ul细 胞 悬 液 (I X l O 6 个细胞)。 3 . 加 入 年 1浓 度 为 3m g /m l 的正常小鼠IgG, 4°C (置冰上)孵 育 lOmin。 4 . 按 表 6. 3. 3 所示,在 1〜5 号试管中加入适量的一抗。将 1〜6 号试管冰浴15min。 5 号管含同型对照Ig,为非特异结合对照管。 6 号管为细胞自发焚光对照,用于 调 定 光 电 倍 增 管 电 压 (photomultiplier, P M T ) ,这一点对巨嗤细胞的检测尤为 重要。 5 . 在 7 号管中加入5M1 E M A 溶液,混匀。将 试 管 放 在 白 炽 灯 (如 40W 白炽灯) 18cm 远处,室温静置l〇min。 6 . 若 样 品 含 红 细 胞 (如 新 鲜 骨 髓 或 脾 脏 ),加 入 3ml A C K 裂 解 液 。否 则 ,加人 3ml P B S 0 7 . 盖紧试管盖,颠倒试管1〜2 次 ,将细胞混勻后,室温静置3min。 8. 4°C , 150吆 离 心 3min。倒掉上清,试管直立后,用手指轻轻弹松管底细胞沉淀。 9 . 加 入 3ml P B S 洗涤细胞,方法同步骤7 和 8。 IOa. 直接检测时:加 入 200julPBS重悬细胞, 4°C 避 光 待 检 (可保存< 4 h)。 10b. 固定后检测时:加 入 100jul2 % 甲醛,混匀,加盖, 4°C 避光固定I h 后待检。 甲醛会改变细胞的光散射值。 1 1 . 用流式细胞仪进行检测,然 后 用 FACScan分析结果" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/A1469600670967vafagyeytrpng_small.jpg" style="width: 567px; height: 446px;" />
MCSF联合药物对单核细胞 作用
实验遇到的问题,希望有大神可以给些想法!实验材料是人外周血,CD14 beads 拿到 monocyte。贴壁2小时后, 对照组MCSF 单独作用, MCSF + 药物为实验组。7 天后明显实验组贴壁的巨噬细胞多。(MTT 实验已经证明)问题: 这些贴壁多的细胞是药物引起的增值? 还是提高单核细胞存活率,从而7天后拿到更多贴壁细胞。有兴趣的可以一起讨论。
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