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免疫荧光和细胞分离

标签: 多克隆抗体 标记 精编免疫学实验指南 第四章

流式细胞仪用于分析细胞表达的膜表面抗原和胞内抗原,能够特异性地区分异质性群体中的不同细胞类型、评价分离细胞亚群的纯度、分析细胞大小和体积。该技术主要检测结合了某种细胞抗原分子的荧光偶联抗体或配体的荧光强度。

作者:J.E.科利根等,译者:曹雪涛等,本实验来自「精编免疫学实验指南」

实验方法
  • 免疫荧光和细胞分离
实验步骤

基 本 方 案 1 单细胞表面抗原的免疫荧光标记

材 料


基 本 方 案 2 固定和渗透单细胞的细胞内抗原的免疫荧光标记

材 料



辅 助 方 案 1 用 异 硫 氰 酸 荧 光 黄(FITC) 偶联抗体

材 料


6 . 计算荧光素/蛋 白 质 比(F/P ):
F/P = F I T C 摩尔数/蛋白质摩尔数; F/P = 5 : 1〜6 : 1 最适于流式细胞仪使用。

辅 助 方 案 2 长臂生物素偶联抗体

遵 循 F I T C 偶 联 方 法(见辅助方案 1),替换以下试剂和步骤见特别说明。
附 加 材 料(其 他 材 料 见 辅 助 方 案 1 , 带 V 项 目 见 附 录 1)

V 琥珀酰亚胺乙酯标记缓冲液
10m g /m l 长 臂 生 物 素(long-armed Biotin, Z y m e d 公司)溶 于 D M S O ,临用前配制
1 . 用 与 F I T C 偶联相同的方法透析 1〜2m g /m l 的纯化抗体。在透析时,用琥珀酰亚胺
乙 酯 标 记 缓 冲 液 代 替 F I T C 标 记 缓 冲 液 。在 A 28。处 检 测 吸 光 度 ,确 定抗体浓度
( = A 280 X 0.74 X 稀释倍数)。
2 . 每毫克抗体加入 IOm I 的 lOmg/m l 用 无 水 D M S O 配制的长臂生物素。室 温 孵 育 lh。
用 与 F I T C 相同的方法去除未结合的生物素(见辅助方案 1)。

备 选 方 案 1 未固定细胞胞内抗原的免疫荧光检测

附 加 材 料



备选方案 2 用 7-氨基放线菌素 D (7-A A D ) 标记死细胞

附 加 材 料


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