5m C i / m l [y-32P ] A T P (3000Ci/m m o l ; D u P o n t N E N ) : 在准备反应混合物前 一小时将其在冰上融化
冰预冷的改良 R I P A 缓冲液
I X S D S /上样缓冲液
细 胞 刮 具(用于贴壁细胞)
Labquake 摇 床(PGCScientific)
l 〇〇°C 加热块
W h a t m a n 3M M 滤纸
注 :除洗涤外,所有的步骤均在冰上或 4°C 冷室进行。 收 集 无 需 活 化 的 细 胞 。
la. 对于悬浮细胞,需室温, 500 g 离 心 I O m i n 收集 ,弃上清,以冰预冷的 P B S 重悬细 胞 。如前所述离心和弃上清。对于贴壁细胞,当 细 胞 贴 壁 时 以 5〜I O m l 冰预冷的 P B S 洗一次,旋动并吸弃 P B S 。于 IO7〜IO8 个 细 胞 加 2〜3m l 冰 P B S ,以细胞刮具 收集细胞。如前所述悬浮细胞的条件离心。如有必要,于一 70°C 保存细胞沉淀,细 胞裂解物不能冰冻(步 骤 5)。
2a. 加 入 I m l 冰预冷的含蛋白酶抑制剂的 I X 细胞裂解液并涡旋混匀,冰上静置 lOmin。 收 集 不 同 时 间 进 程 的 活 化 细 胞 。