可变区 MgC. ChIASc 5’-AGGTCTAGAA (C yT) CTCCACACACAGG (A/G) (A ,G) CCAGTGGATAGAC- 3, a. 存在兼并性的核_ ff酸,已经在某位置用可替换的核苷指出。底下画截的是Xfe2I 克隆位点。 b. 能与鼠科动物K恒定•区的氨基酸122~116的编码序列杂交的序列。 c. 能与小鼠除IgG3 的免疫球蛋白中ChI 中的氨基酸13.0〜120的编码序列杂交的反义引物 9. 5U/ V1禽成髓性白血病病毒( AMV) 反 转录酶( Promega),1/10稀释于反转录 酶 缓冲液( 附录1) 2〇!wnol/L 针对小鼠的重链和轻链可变区的上游引物( 表 1. 8. 2 和 表 1. 8. 3) 表 1.8. 2 扩 增 鼠 重 链 可 变 区 引 导 区 域 的 5'端正义引物 PCR引物* MHALT1. RV MHALT2. RV MHALT3. RV MHALT4. RV 引物序列b 5 '-GGGG AT ATCCACCT AGGCA/G) ATG(C yG) AGCTG(T/G)GT(C, A) AT(C "GjCTCTT-S’ 5 '-GGGGATATCCACCTAG (A/G) ACTTCGGG(T/C) TGAGCT(T/G ) GGTTTT-37 5 ^ g g g g a t a t c c a c c t a g g c t g t c t t g g g g c t g c t c t t c t -s, 5 ^-GGGGATATCCACCTAGGC A/G) CAG (G/A)CTTAC(T/A)AT(C .T) (T/C)-3' a. 设计的Y端引物为可以同重链引导序列的氨基末端杂交的。所有引物同时应用,用于扩增未知序列。 b.EcaRV位 点 ( 画线处)被 V端的三个鸟嘌呤保护。核糖体结合位点用黑体表示。简并性核苷酸在某位置用 可替换的核苷标出。 PCR引物a MHALT1. RV MHALT2, RV MHALT3. RV MHALT4. RV MHALT5. RV MHALT6. RV 表 1 , 8 . 3 扩 增 鼠 轻 链 可 变 区 引 导 区 域 的 5'端正义引物 引物序列1 5 5 ^ g g g g a t a t c c a c c a t g g a g a c a g a c a c a c t c c t g c t a t -3; 5’-GGGG AT ATCCACC ATGGATTTTC AGGTGC AGATTTTCA03, 5^GGGGATATC CACCATG (G /A) AGTCACA(G/T) AC(T/C)CAGGTCTT(T/C) (G /A)TA-3’ 5 ^GGGGATATC CACCATGAGG (G/T) CCCC(A/T) GCTCAG(C/ T) TC. T() CT(T;G) GG(G/A)-3, 5 ^ g g g g a t a t c c a c c a t g a a g t t g c c t g t t a g g c t g t t g -s' 5/-GGGGATATCCACCATGATGAGTCCTGCCCAGTTCC-3, a. 设计的6 个引物为可以同鼠轻fe引导区域的氨基末端杂交的。所有引物同时应用,用于扩增未知序列。 b.EcoRV位 点 ( 画线处)被 5'端 的 3 个鸟嘌呤保护。核糖体结合位点用黑体表示。简并性核苷酸在某位置用 可替换的核苷标出 2U/M1 Tag DNA 聚合酶 I.25mmol/L 4dNTP溶 于 TE: 每种dNTP浓度为I.25mmol/L并溶于TE缓冲液 中, pH7.5 (附 录 1)。分装成Imi/支,在一20°C可以保存1 年。 V 10 XPCR扩增缓冲液 石蜡油 氯仿 T A 载 体 ( 见辅助方案;也可从Invitrogen购得) 第一章免疫应答导论 " src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/B1469434935870absesdrxjtpng_small.jpg" style="width: 505px; height: 729px;" />