实验步骤 |
材料靶抗原:表达于细胞的抗原,或蛋白质、多肽 生理盐水 无血清培养基:仅用于细胞接种 弗 氏 完 全 佐 剂( complete Freunds adjuvant, CFA), Sigma 公司 实验动物:无 病 原 体 大 鼠 、小 鼠(推 荐 使 用 BALB/c小 鼠)或 仓 鼠(推荐使用Cytogen研究所的美洲仓鼠) 弗 氏 不 完 全 佐 剂( incomplete Freunds adjuvant, IFA), Sigma 公 司 ,可选用1〜2 ml玻 璃 注 射 器(有 Luer-Lok接头,已消毒) 三通管 IOOml烧杯 20 G 注射针头,已消毒 1.将2 X 106〜5 X 107 个 细 胞 或 1〜50 ug 蛋白质或多肽置于生理盐水中制备成抗原。如果免疫原为细胞,在接种前将细胞于无血清培养基中清洗3 次 。在 融 合 实 验(见基本 方 案 2 ) 前 至 少 3d 准备好已免疫接种的实验动物(足够用于几次的融合)。 2.使用1〜2 ml玻 璃 注 射 器(有 Luer-Lok接头)吸取抗原,连接三通管。 3.完全混匀CFA以打散结核分枝杆菌。用另一支玻璃注射器吸取与抗原液等量的CFA并连接装有抗原的注射器(图 1.2.1)。 4.将 抗 原 液 反 复 注 入 CFA 再 抽 出 直 至 稠 化 混 合 ,制 成 乳 状 液 。取 50m l冷水置于IOOml烧杯中。挤出一滴乳状液滴于冷水表面以检测乳状液是否稳定。如果乳状液呈液滴状在水面聚集,则进入步骤5。如果液滴散开则继续混合操作直至稳定的乳状液形成。 5.将乳状液移入一个注射器,将另一个注射器和三通管移去。将 已 消 毒 的 20 G 注射针头安装于注射器上以封闭乳状液。 6.麻 醉 大 鼠(附 录 2D) ,或 固 定 小 鼠 或 仓 鼠(附 录 2 0 。腹腔内注射乳状液,剂量为(附录2E) : 大鼠每只0.5〜lml、小鼠每只小于0.2 ml、仓鼠每只0.2〜0.4 ml。将针头插入皮肤并于皮肤与腹膜壁间穿行一段距离后,再刺入腹膜腔。避免用力压迫注射器的活塞以免过度的压力使针头与注射器分离,造成乳状液的喷溅。在拔出针头前转动针头以减少渗出。 7.于 10〜14d 后以大约相同剂量的抗原二次免疫动物。如果计划在免疫3d 后进行细胞融合实验,则使用水相溶解的游离抗原或休眠期的完整细胞进行免疫。如果不立刻进行细胞融合,则 应 用 IFA (不含有结核分枝杆菌)乳化的抗原进行免疫,而不使用 CFA。 8 . 如果需要,可以于初次和二次免疫后的7〜IOd用 ELISA (单 元 1 . 1 ) 或免疫沉淀法(单元12. 2 ) 测 定 抗 体 滴 度(单 元 1.2)。
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实验步骤 |
在 筛 选 检 测(辅助方案 1 ) 方案完善之前不应进行细胞融合。由于在细胞融合后可对目标单克隆抗体进行检测的次数是有限的,在细胞融合前必须检查条件培养液以排除筛选时可能出现的人为因素影响。 材 料SP2/0-Agl4 骨 髓 瘤 细 胞 系(药物标记的非分泌型; ATCC) 添加10 mmol/L HEPES 和 lmmol/L丙酮酸钠的 DMEM-10和 DMEM-20 完全培养基(附 录 1) 免疫的实验动物:小鼠、大 鼠 或 仓 鼠(在 初 次 接 种 后 10〜14d 备 用 ,见基本方案1) 5 0 % (m/V) PEG 溶液,无菌 DMEM完全培养基,未添加血清 氯化铵溶液:〇. 〇 2mol/L T ris. Cl, pH7.2(附录 I)/O .14mol/L NH4C1 添加 10 mmol/L HEPES、 lmmol/L 丙酮酸钠、 I X HAT 或 I X HT 的 DMEM-20完全培养基,取 自 IOOX包 装(以 Sigma公司产品为例),储 存 于 4°C一个月7 0 % (V A O 乙醇,仅用于容器消毒 175 cm2 组织培养用细颈瓶 倒置显微镜 400 ml和 600 ml烧 杯(各 3 只) IOOmm有盖培养皿 尖头镊和解剖剪 细网金属筛 50 ml塑料锥底离心管,无菌 Beckman离心机和TH-4转子或同等设备 9 6 孔平底微量滴定板 Im l和 IOml 移液管 1.细胞融合前一周,幵 始 在 添 加 HEPES 和 丙 酮 酸 钠 的 DMEM-10 完全培养基中培养SP2/0-Ag1 4 骨 髓 瘤 细 胞 系(融合用细胞)。在细胞融合操作前骨髓瘤细胞对于不同的实验动物应达到以下水平(每 个 175 cm2 培 养 瓶 含 培 养 液IOOml) : 小 鼠 , IXlO8个细胞/瓶 , 2 或 3 瓶 ;仓鼠, 2 X 108 个细胞/瓶 , 3 或 4 瓶 ;大 鼠 , 5 X 108〜IXlO9个细胞/瓶 , 1 0 瓶 。 2.细胞融合前3d,进 行 二 次 免 疫(见基本方案 1 ,步 骤 7)。 3 . 细胞融合前ld, 转 移 SP2/0-Ag1 4 骨髓瘤细胞至新鲜的添加 HEPES 和丙酮酸钠的 5.将以下物品于37°C预热: 20 ml 无菌的未加血清的DMEM完全培养液; 5 ml无 菌 的 5 0 % PEG溶液。 6.处死二次免疫的实验动物(附 录 2 G)。不要用麻醉法处死动物。对 于 小 鼠 ,应用颈椎脱臼法,对于大鼠和仓鼠应用二氧化碳窒息法,取 脾 脏(附 录 2 H)。 7.将脾脏移至预置了 IOml无菌的未加血清的DMEM完 全 培 养 液 的IOOmm培养皿中。以下操作要求在层流罩中超净工作台完成。 8.使用尖头镊压碾或解剖剪将脾组织剪碎,移去组织碎片并通过细网金属筛进一步分离细胞,制成单细胞悬液。 9.将脾细胞悬液移至已消毒的50 ml塑料锥底离心管,并 用 无 血 清DMEM完全培养液加 满 离 心 管(不要使用含有蛋白质或HEPES 的培养液)。室温下, TH-4离心机中500 g 离 心 5 min, 弃上清。 10.在 5 ml氯化铵溶液中将细胞沉淀重悬以裂解红细胞。在 室 温 下 静 置 5mirx,加入45 ml无 血 清 DMEM完全培养液,如 步 骤 9 进行离心。 11.加 入 50m l无 血 清 DMEM完 全 培 养 液 ,将 沉 淀 重 悬 ,并 再 次 离 心 。重复添加DMEM和 离 心 1 次 ,以完成2 次洗涤。 12.在洗涤脾细胞的同时,将 SP2/0-Agl4 骨 髓 瘤 细 胞 移 入 50 ml塑料锥底离心管。如步 骤 9 进行离心,分离细胞。在 DMEM中重悬细胞,如 步 骤 1 1 洗涤骨髓瘤细胞3 次 。 13.分 别 在 IOml无血 清DMEM完全培养液中重悬脾细胞和骨髓瘤细胞。用细胞计数器和台盼蓝拒染试验对两种细胞悬液进行细胞计数和活力测定(附 录 3 0 。此时两种细胞悬液应该都具有1 0 0 % 的细胞活力。 14.在 细 胞 计 数 的 基 础 上 ,以 约 2. 5 X IO6 个 总 细 胞 数 /m l计 算 培 养 细 胞 所 需 添 加HEPES和丙酮酸钠的DMEM-20 培养基的量。 37°C水浴预热此培养基。取 9 6 孔平底微量滴定板做好标签备用,每 IOml 细胞悬液需准备一个孔板。 15.将 SP2/0-Agl4 骨髓瘤细胞与脾细胞以I : I (V/V ) 的 比 例 在 50m l塑料锥底离心管中混合。以无血清DMEM完全培养液加满离心管。室温下, 500 g 离 心 5 min。 16.在进行细胞离心的同时,在 层 流 罩 中 准 备 三 个 600m l烧 杯(步 骤 5),内 盛 75〜100 ml 37°C温水,再 将 3 个 内 盛 100 ml 37°C温 水 的 400 ml烧杯分别放入600 ml烧杯中,形成水浴环境。将 预 热 的 5 0 % PEG溶液试管与无血清DMEM完全培养液试管(步 骤 5 ) 分别放入 2 个 37°C水浴中。 17.吸取并丢弃混合细胞离心的上清部分(步 骤 15),并将离心管置于第三个水浴烧杯中。使 用 Iml移液器向混合细胞沉淀中加入Iml预 热 的 5 0 % PEG,在 Imin内勻速逐滴缓慢加入,每加入一滴即用移液器轻轻搅匀细胞。滴加完成后轻轻搅匀lmin。 18.使用干净的移液管向混合细胞液中逐滴加入预热的无血清DMEM完全培养液,加入的同时轻轻搅匀: Imin内匀速滴加 Iml DMEM; Imin内匀速滴加Iml DMEM; 2〜3 min内匀速滴加7 ml DMEM (使用IOml移液管)。 注意,此时应有肉眼可见的细胞团漂浮。室温下, 500 g 离 心 5 min。 19.在进行细胞离心的同时,将水浴烧杯重新加热到37°C ,并放入层流罩。将预热的添加 HEPES和丙酮酸钠的DMEM-10 完全培养基放人水浴。 20.弃 上 清(步 骤 18),将试管放入水浴。用 干 净 的IOml移液管将预热的添加HEPES和丙酮酸钠的DMEM-10 完全培养基用力吹入细胞沉淀。连续添加,直到将所有培养基加入步骤1 4 准备的培养基。如果培养基体积超过了 50 ml,小心地吸取多余量
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实验步骤 |
附 加 材 料(其他材料见基本方案 2) 在 9 6 孔板中生长的杂交瘤(见基本方案 2) 添 加 10 mmol/L HEPES的 DMEM-2 0 完 全 培 养 基(附 录 1) 多道移液器和9 6 孔板,可选的 1.在倒置显微镜下观察生长的杂交瘤的孔数。确定是对所有孔进行细胞筛选还是只筛选长有杂交瘤的孔。 2.将生长的杂交瘤在CO2 培养箱中培养≥ 2 d,以使抗体达到饱和滴度。 3.用微量移液器从每个孔中取IOOmI 培养上清用于检测或筛选分析,如 ELISA (单元1.1 ) 或间接免疫荧光法(单 元 4.1)。 每操作一个孔需更换新的枪头。如果是对所有孔进行细胞筛选,使用多道移液器可以方便地将培养上清移入另一个 9 6 孔板中。注意保持样品的顺序一致,行 、列标签明确。如需对大量样本进行筛选,可以将几个孔的样品合并入一个孔。一般情况下,检测结果中只有小于 1 % 〜5 % 的杂交瘤可以表达具有所需特异性的抗体(此时的抗体还不是单克隆抗体)。 4.当完成一整块孔板的取样后,用 新 鲜 的 添 加HEPES的 DMEM-20完全培养基培养液填满孔板,再对下一块孔板进行操作(见基本方案 2 , 步 骤 23)。
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实验步骤 |
在单克隆抗体的特异性得到充分验证之前,应该对所有候选的杂交瘤进行建系。但为了减少不必要的工作量,可以选择其中 2 0 个最佳的候选孔。在检测这 2 0 个孔的培养上 清(见辅助方案1 ) 为阳性后,应该将这些孔的细胞进行冻存,同时进行有限稀释。 附 加 材 料(其他材 料 见 基 本 方 案 2) 生 长 的 杂 交 瘤(见基本方案 2) 克隆和扩增用培养基(见辅助方案 4) 2 4 孔板 4 ml 有盖试管,无菌 1.当 9 6 孔板中生长的杂交瘤长到 2 5 % 〜5 0 % 汇 合 时(主要孔),用 无 菌 的 移 液 器(调节 为 100ul 的微量移液器)将主要孔中的细胞重悬,并将孔中全部内容物转入 2 4 孔板的一个孔,保证有足量的细胞在此扩增孔中扩增。若是从一个长有成纤维细胞的孔中转移细胞,应该尽早进行转移操作,以免成纤维细胞过度生长,并且操作时切忌 刮 到 孔 底(这样做会松动成纤维细胞)。 2.用Iml移液器在主要孔中滴入 3 滴 添 加 10 mmol/L HEPES和lmmol/L 丙酮酸钠的DMEM-20完 全 培 养 液(见基本方案 2 , 步 骤 23),放 回 CO2 培养箱培养。 3.用干净的移液器取 1〜1.5 ml 用于克隆和扩增的培养基加入2 4 孔 板 , CO2 培养箱培养 2〜3d。主要孔与扩增孔要用不同的移液器从不同的试剂瓶中取用培养基。 4.当 2 4 孔板中的细胞长到 2 5 % 〜5 0 % 汇 合 时(2〜3d),用有限稀释技术进行克隆操作(见辅助方案 3)。而当主要孔中的细胞长到 2 5 % 〜5 0 % 汇合时,必要时可重复步骤1〜30 5.完成有限稀释操作之后,将 2 4 孔板中多余的细胞移入 4 ml无菌有盖试管中。用添加HEPES和丙酮酸钠的DMEM-20完全培养液继续培养 2 4 孔板中的细胞。 6.将 前 述 4m l 管于室温, 500 g 离 心 5 min。将上清保留以备进一步抗体鉴定或作为对照 。冻 存 细 胞 沉 淀(附 录 3B)。如果已确定建立了稳定的细胞克隆,那么细胞建系就完成了,将其冻存,并确保可被顺利复苏。 7.如果有限稀释操作不能培养出有抗体分泌活性的细胞系,则复苏那些之前从 2 4 孔板中分离的细胞。将其重新在 2 4 孔板中培养,过 夜 ,并用这些细胞重新建立有限稀释孔板。将其冻存并妥善保存。
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实验步骤 |
附 加 材 料(其他材料见基本方案 2) 候 选 杂 交 瘤 系(见辅助方案 2) 克隆和扩增用培养基(见辅助方案 4) 微 孔 板 观 察 镜(由 Flow 实验室或 Dynatech 公司提供),可选的 1.重悬候选杂交瘤所在孔中的细胞(见 辅 助 方 案 2 , 步 骤 4),用血细胞计数器和台盼蓝 拒 染 试 验(附 录 3C) 对 一 部 分(50|ul) 细胞进行计数和细胞活力测试。 2.以每毫升 5 0 个活细胞和每毫升 5 个活细胞的量分别准备 IOml 含有克隆和扩增用养 基 的 细 胞 悬 液(根据需要多次稀释)。将 细 胞 悬 液 移 种 至 9 6 孔 板 ,每 个 孔 200ul(最终每孔分别为 1 0 个细胞和 1 个细胞)。 CO2 培养箱中培养 7〜10d。 3.观察出现杂交瘤生长的孔数,以确定哪一种稀释度对于单克隆的生长是最佳的。把孔板举高肉眼观察或使用微孔板观察镜对杂交瘤进行观察。 4.在继续细胞培养之前,用倒置显微镜观察单克隆细胞。单一的致密细胞集落是单克隆细胞增殖的典型特征,而多克隆细胞增殖往往出现多个细胞集落,尽可能不要使用多克隆细胞生长的孔。 5.应用与筛选主要孔细胞(见辅助方案1 ) 相同的方法检测培养 7〜14d 的单克隆细胞分泌目标抗体的活性(对于小鼠-小鼠杂交瘤应于第 7 天 ;所有的孔都应该在其颜色变黄时进行检测)。使用部分原杂交瘤的培养上清(见 辅 助 方 案 2 , 步 骤 6 ) 作为阳性对照。 6.如果已经确定得到了所需的细胞克隆,按与原杂交瘤相同的方法(见辅助方案2 ) 扩增并冻存这个细胞克隆。 7.按 步 骤 1 和 2 再次克隆阳性杂交瘤克隆,配 制 含 有 6 0 个 活 细 胞 的 40m l 克隆用培养基(最 终 为 0.3 个细胞/孔),重复步骤 4〜6。 8.连 续 3 天 ,每天以 1 : 2 的比例将再次克隆的细胞转入 DMEM-10完全/HEPES/丙酮酸钠培养液,以使所需的杂交瘤成为稳定的细胞系。一株偶然克隆的杂交瘤会无法适应 DMEM-10完全/ HEPES / 丙酮酸钠培养液的环境,并要求较高浓度的 FCS。 因此,在 转 入 DMEM-10培养基之前先将细胞转入 DMEM-1 5 培养基。在此过程中应谨防支原体污染(附 录 3F)。 9.在不同天数冻存多个装有细胞的小瓶(含各不相同量的冻存用培养基,见 附 录 3B)。复苏样品瓶,以适当方法检测细胞生长活性和培养上清中单克隆抗体(MAb) 的活性 。应用杂交瘤大规模制备腹水和培养上清(单 元 1.4)。检 测 M A b 的 同 种 型(单元 1. 1) 即使是再次克隆的杂交瘤也会具有不稳定性,尤其是某些仓鼠-小鼠杂交瘤。这样的杂交瘤需要继续进行克隆。长时间的体外培养可能导致 M Ab 的不分泌。为了减少这一问题带来的影响,将部分已知可以生产 M Ab 的细胞冻存起来是必要的,同时这些细胞将来也可以作为活性细胞的来源。
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实验步骤 |
附 加 材 料(其他材料见基本方案 2) 小鼠(以 BALB/c 小鼠为例), 5 或 6 只 , 4〜6 周龄,无 病 原 体(有可靠来源,避免支原体感染) 75 cm2 组织培养用细颈瓶 0.45 过滤装置 1.用颈椎脱臼法或二氧化碳窒息法处死 5 或 6 只 小 鼠(附 录 2 G; 避免使用麻醉剂)。无菌操作取出胸腺(附 录 2 H) 并 制 成 单 细 胞 悬 液 (见基本方案2 , 步 骤 7〜9)。在20m l 添 加 lOmmol/L HEPES和 lmmol/L 丙酮酸钠的DMEM-20完全培养液中重悬细胞。 2.加IOml 胸 腺 细 胞 至 75 cm2 组 织 培 养 瓶 中 。以 每 个 胸 腺 20m l 培养基的总量加入DMEM-20完全/HEPES/丙 酮 酸 钠 培 养 液 (最多每个培养瓶 60 ml细胞悬液)。垂直放置 ,培 养 4〜5d 3.将 细 胞 悬 液 移 至 无 菌 50m l 锥 底 离 心 管 中 。室 温 下 , IOOOg 离 心 5 min,取 上 清 。0 .45 Mm 过滤上清液。以 IOml 为一个单位,一 20°C 冻存。解冻后,以 1 0 % 〜2 0 % 的浓度使用。
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