分析磷酸化位点最常见的方法是用同位素(如32P或33P)来标记蛋白,但是内源ATP和GTP的存在会导致低效标记,而且放射性标记本身不能精确显示磷酸化位点,所以需要一种替代的方法。MS正在逐步成为一种非放射性分析磷酸化的选择。[澳]理查德J.辛普森(RichardJ.Simpson)主编何大澄主译
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实验步骤 |
一、IMAC 树脂的制备 二、多肽样品的制备
三、用 NanoscaleIMAC 纯化磷酸化多肽
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实验步骤 |
方法 A: 在 MALDI-MS 分析之前在溶液中去磷酸化的方法1.根据方案 1 中的附加方案,准备两个 nanoscale 去盐柱子(PorosR2 或 PorosR3)。在孵育期间,用 5% 的甲酸保证树脂湿润(第 3 步),GELoader? 吸头的上端作为一个反应室。 2.在每一个反应中,加 20ul 碱性磷酸酶到 50 mmol/L NH4HCO3 中,然后再稀释 1~2ul 的多肽样品到碱性磷酸酶溶液中(最后反应溶液的 PH 为 8 左右,必要时用 50 mmol/L NH4HCO3 进行调整,也可以用 pH 试纸检测)。
3.GELoader 吸头于 37°C 孵育 45 min,使多肽去磷酸化。 4.加入 2ul 15% 的甲酸,酸化样品,通过注射器施压把样品加到 Poros 树脂上。 5.用 20ul 5% 的甲酸洗涤柱子,然后再用 1ul 饱和的 MALDI 基质洗脱柱子,为得到较好的敏感性,把洗脱液按 5?8 小滴加到 MALDI 板上,第 1、2 滴是主要分析的组分。 6.分别记录从第⑤步中得到的样品及对照组样品中的一部分磷酸化多肽的 MALDI 反射-TOF 和 MALDI 线性-TOF 谱图。 方法 B:MALDI-MS 分析后在溶液中去磷酸化此法对于 DHB 和 CHCA 两种 MALDI-MS 基质都适用。 1.根据方案 1 中的附加方案,准备两个 nanoscale 的去盐柱子(poros R2 或 Poros R3)。在孵育期间(第④步),用 5% 的甲酸保证树脂潮湿。 2.用 GELoader 吸头的上端作为一个反应室。在每一个反应室中加 204 碱性磷酸酶到 50 mmol/L NH4HCO3 中。
3.记录多肽混合物的 MALDI 反射-TOF 和 MALDI 线性-TOF 图谱。 4.用微量加样器取0.5~1.5ul 的 70% 乙腈+0.05mol/L NH4HCO3 小心溶解分析物/基质结晶,把等体积的溶解的分析物/基质结晶直接转移到每一个反应室里。 为成功得到分析图谱,不锈钢表面的 MALDI 板必须是「磨光」的或是 AnchorChip0 5.GELoader 吸头在 37°C 孵育 45 min,使多肽去磷酸化。 6.加人 2 倍体积的 5% 的甲酸,酸化样品,通过注射器施压把样品加到 Poros 树脂上。 7.用 20W5% 的甲酸洗涤柱子,用 1ul 饱和 MALDI 基质洗脱柱子,为得到最佳的敏感性,把洗脱液按 5~8 小滴加到 MALDI 靶板上,第 1、2 滴是主要分析的组分。 8.记录碱性磷酸酶处理的多肽的 MALDI 反射-TOF 和 MALDI 线性-TOF 谱图 方法 c: MALDI-MS 分析后在靶板上去磷酸化此方法仅适用于 CHCAMALDI-MS 基质。 1.分析分析物/基质结晶中得到 MALDI 反射-T0F 和 MALDI 线性-TOF 谱图后,用 1.5ul 含有 0.05U/ul 碱性磷酸酶的 0.05mol/L NH4HCO3 溶液在靶板上溶解基质。 2.将靶板放置于一个封闭的塑料盒中,盒中放置湿的织物,以防样品干燥,37°C 孵育 30 min。 3.用 0.5ul 5% TFA 酸化样品,这样是为了使基质再结晶。 4.在 MALDI 分析去磷酸化多肽之前,用 0.1% TFA 轻轻洗涤基质微晶体的表面,以洗掉来自去磷酸化缓冲液中的盐分和甘油,将 10ul 0.1%TFA 滴到基质上,静置片刻后迅速用织物的边缘去除 TFA 溶液。
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实验步骤 |
一、固定化金属离子亲和柱的制备
二、磷酸化多肽与 IMAC 柱的结合
三、碱性磷酸酶处理亲和结合的磷酸化多肽 四、羧肽酶 Y 消化亲和结合的磷酸化多肽
五、质谱
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实验步骤 |
一、IMAC 微柱的构建制备
二、磷酸化多肽的富集
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实验步骤 | 1.根据制造商的建议,制备、清洗、平衡 uLC 柱。 柱子的流速决定于柱子本身,一般 50um (内径)的柱子为 200nl/min 左右,100um (内径)的柱子则为 500nl/min 左右。通过调节毛细管前方的 T 形分离装置中的毛细管的长度(靠经验确定)进行分流,从而实现对流速的控制。这一装备可用于一般的 HPLC 泵,如能把流速控制在 0.5~4.Oml/min 范围,就可用于毛细管柱的操作。 2.加蛋白质样品(见方案 4 第15 步)到 uLC 柱上。 3.用 0~60% 的线性梯度溶液 B 洗脱,洗脱多肽 50 min 以上,从柱子上洗脱下来的多肽通过 micro-ESI 接口引入 MS。 4.而后对多肽进行 CID 分析,借助 MS 进行片段化选择使用自动化的数据依赖型 MS/MS 程序,该程序在绝大多数 MS 控制软件包中均可选择使用。 |
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实验步骤 |
一、SDS-PAGE 分离的 Gab-I 蛋白的消化1.把通过自显影确定的含有磷酸化蛋白的条带切下来。 2.将凝胶切成 1mm2 的条带,把它们放到检测管中。 用特定的不含 Na+、K+的试管消化,否则 Na+、K+的化合物会在 MS 中出现。 3.用消化缓冲液 A 洗凝胶条,37°C,lOmin。 4.用消化缓冲液 B 洗凝胶条,37°C,lOmin。 5.重复③、④步两次以上。 6.室温下加乙腈使凝胶条带脱水,直到胶条变白(约 3 min)。 7.加蛋白酶溶液,37°C,20 min,使凝胶膨胀。 酶解温度取决于所用的蛋白酶(例如,Glu-C 需要在 25°C,而胰蛋白酶需要在 37°C)。 8.在凝胶块上加消化缓冲液 A 防止其干燥,37°C 下孵育过夜。 二、用于阴离子交换色谱的凝胶条带的抽提9.加 20ul 消化缓冲液 A 到凝胶中,4°C 下超声 20 min。 10.收集上清。 11.重复⑨、⑩步两次以上。 三、阴离子交换色谱12.调整阴离子交换柱的流速为0.5 ml/min。 13.把合并的上清液,加到柱子上。 14.用离子交换缓冲液 A 洗柱子 20 min。 15.用呈现 0~10% 的梯度离子交换缓冲液 B,从柱子上洗脱多肽,持续 40 min,在洗脱过程中每分钟收集0.5 ml 的洗脱液。 16.提高离子交换缓冲液 B 的梯度,即 10%~50%,持续 75 min。 17.用 Cerenkov 计数器测量每一组分的放射性,或测量经闪烁放大的每一组分的放射性。 18.按每一部分的相对放射性对洗脱时间作图(例子见图 9.14)。 四、对有放射性的洗脱液作 RP-HPLC 色谱分析19.从阴离子交换色谱洗脱液中选一个具有放射性的组分。 20.用一个离心干燥器将其体积由 500ul 减小到 80ul。 21.调整 M-HPLC 柱的流速到 704/min。 22.用一个死体积 T-分流器调整 y-HPLC 柱子的流速到 16ul/min。 23.把样品加到一个 80ul 的进样环管中。 24.用 95% 的 pRP-HPLC 缓冲液 A 洗柱子 30 min。 25.UV 检测器调零,光度计的采样频率设为 2 Hz,在 215nm 和 295nm 下对 RP-HPLC 洗脱液进行 UV 检测。 26.用 5%~50% 的梯度 JLtRP-HPLC 缓冲液 B 洗脱,持续 90 min。 27.收集洗脱液,使每一组分的体积为 8~16ul。 28.从每一组分中取 0.5ul 转移到小瓶中进行放射性的测量。 组分的体积依赖于峰的大小 29.将这些组分在-70°C 下迅速冷却,图 9.15 显示了一个典型的 RP-HPLC 色谱图。 五、对于放射性的组分作 MALDI-MS 分析30.从 RP-HPLC 中选一个具有放射性的组分,把0.3ul 的收集液加到不锈钢的 MALDI 板上。 31.加 0.3ul 的基质溶液到样品上,空气中自然干燥(约 1 min)。 32.以线性或反射的模式记录 MALDI 谱图(见图 9.16)。 33.把从 MALDI-MS 谱图中获得的理论计算(inSilic0) 的多肽质量与理论消化憐酸化蛋白(如 GPMAW,Protein-Prospector) 所获得的实验性质量进行比较。要考虑以下几个方面: (1)甲硫氨酸的氧化; (2)氨基端的乙酰化; (3)S、T、Y 的磷酸化(本实例中是 Y 的磷酸化); (4)XXRQXX 和 XXKQXX 上焦谷氨酸的产生; (5)不完全消化。 34.选择可能的鱗酸化多肽做 MALDI-PSD 分析。图 9.17 和图 9.18 显示了磷酸化酪氨酸多肽的 4 种不同 MALDI-PSD 谱图。图 9.19 中显示了多肽一般的片段化模式。
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一、磷酸化蛋白的还原、烷基化和消化1.在不含 Na+、K+的试管中,用消化缓冲液 A 于 37°C 洗凝胶条 10 min。 2.用还原剂覆盖凝胶条,37°C 下作用 15 min。 3.把还原剂洗去,再加烷化剂,覆盖凝胶条,37°C 下黑暗中放 15 min。 避免长时间的放置,因为甲硫氨酸会被碘乙酰胺烷化(Sickmann,etal,2000)。 4.加 5ul β-巯基乙醇到烷化剂中,然后覆盖凝胶条,37°C 孵育 5 min 以上。 5.把液体倒掉,用消化缓冲液 A 洗凝胶条 37°C 10 min。 6.倒掉消化缓冲液 A,用消化缓冲液 B 37°C 下洗凝胶条 10 min。 7.重复⑤、⑥步两次以上。 8.室温,加乙腈使凝胶条脱水直到变白(约 3 min)。 9.加蛋白酶溶液使凝胶膨胀,37°C 下 20 min。 10.用消化缓冲液 A 覆盖凝胶条,防止其干燥。 11.37°C 下孵育过夜。 二、用于 nano-HPLC 分离的凝胶条的抽提液12.弃掉凝胶条中的消化缓冲液,用 15ul 5% 的甲酸覆盖凝胶条,并在一个预冷的超声浴中孵育 20 min。 13.收集凝胶周围的液体,其中含有消化的多肽。 14.重复12、13 步。 三、在 nano-HPLC 过程中釆用前置柱对多肽进行浓缩 nano-HPLC 的流速一般小于 0.3 u1/min,在抽提多肽后,大约可以得到样品,对于做 nano-HPLC 来说,量太大。所以需要像图 9.20 中的那样,对多井行浓缩。此方法的一个优点是样品的在线浓缩会使加人的样品体积减小。 15.把样品加入进样环管,TFA(0.1%) 60 ul/min 下 10 min 将样品浓缩到 c18 预柱上。 16.浓缩后,把 B 阀移到 1-4 位置,进入泵流。 17.按如下方法洗脱多肽: (1)调泵流速度为 7O ul/min(若用 ABI140D 系统)。 (2)用一个前置柱分流器调节柱流速度到 100~200nl/min。 (3)用 nano-RP-HPLC 缓冲液 A 平衡 75um (内径)柱子 10 min。 (4)用 5%~50% 梯度的 nano-RP-HPLC 缓冲液 B 洗脱多肽 90 min 以上。 四、LC-MS/MS 分析18.用纳喷离子源和 micro-ESI 接口把多肽加样到 ESI 质谱仪中。 19.用三重扫描过程(全扫描、第一次数据依赖型 MS/MS 扫描、第二次数据依赖型 MS/MS 扫描),记录 MS 谱图,每一次扫描都持续 2s。 五。用 SEQUEST 法则进行数据自动化分析 20.用 SEQUEST 软件自动处理 LC-MS/MS 的原始数据文件。
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一、多肽的消化和浓缩
二、用 SEQUEST 法则进行数据自动化分析
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