标签: 质谱 电泳胶 MS 基本技术 蛋白质与蛋白质组学实验指南第八章
电泳胶分离的蛋白质质谱(MS)鉴定方法是蛋白质组学的基本技术平台。事实上,由于质谱的灵敏度更高、能处理混合蛋白样品,并且具有更高的样品通量,所以它基本上取代了Edman降解法这一蛋白质鉴定的经典技术。目前以质谱为基础的蛋白质组策略基本上是利用有序列特异性的蛋白酶,对一维(1D)凝胶或者二维(2D)凝胶分离的蛋白进行凝胶原位酶解,使之成为肽段。
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实验步骤 |
1.吸取 0.5ul 的基质溶液,加到 MALDI-MS 分析所用的金属样品板上的样品孔中(为了准确起见,请使用2ul 的移液器)。 2.在基质干燥之前,迅速加入 0.5ul 的标准品或样品到基质中。 3.置于室温条件或 40℃ 的烘箱内约 5 min,让溶剂蒸发以使样品干燥。 4.把金属板转移到质谱仪的真空舱内。 5.以恰好高于离子化阈值的激光能量来「预热」校准标准品,从而获得初始质量图谱。 6.然后,降低激光能量直到获得高质量的图谱。 7.用适合的校准物来获得线性的两点(two—point) 外标校准(参考表 8.9 和表 8.10) 8.对未知样品重复步骤 5 和步骤 6, 并与校准值相比较以获得精确的质量。 9.使用完毕后,用水彻底冲洗 MALDI 板以除去任何可见的晶体,然后再用无棉绒薄纸(例如,Kimwipes 纸)沾甲醇擦拭。
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1.将 GELoader 移液吸头的尖端压扁。图 8.32 所示为两种最常用的操作方法: (1)将 GELoader 移液吸头的细端平放在坚硬的表面上,用一个 1.5 ml 的微量离心管滚过移液吸头尖端约 Imm 的部位。 (2)用平头镊子挤压 GELoader 移液吸头的尖端,然后将移液吸头旋转一圈,以封闭其末端。 2.制备溶于 70% 乙腈的层析树脂(PorosR1、PorosR2 或 Oligo R3) 悬液 100~200ul(约 1.5 mg 树脂/100ul 乙腈)。 步骤③~⑧的操作如图 8.32(b) 所示。 3.把 20ul 70% 的乙腈装人压扁的 GELoader 移液吸头的尖端,在乙腈上面加人0.5 沁的树脂悬液,然后通过一个一次性的移液吸头将装有树脂的 GELoader 移液吸头连接到合适的 1ml 注射器上,用注射器将液体轻轻地压出。如此,在压扁的微型层析柱的末端形成一个小的层析柱床。在进行下一步实验之前,让所有的液体流出柱底,并使层析柱干燥。 黄色移液吸头必须被剪切两次,才能既适合注射器又适合 GELoader 移液吸头。用来制备层析柱的树脂悬液的量应该随着样品的浓度而变化。 总的说来,当分析物为凝胶分离的低丰度蛋白的肽段时,层析柱的高度应该在 1?6 mm(柱床体积大约为 10~60 nl)。 4.在层析柱顶端加人 20ul 0.1% 的三氟乙酸。由注射器产生的空气压力轻轻地将 IOul 0.1% 的三氟乙酸推过层析柱,使其平衡。剩余的 10ul 0.1% 的三氟乙酸则存留在尖端的柱床上面。
5.把蛋白质/多肽样品加到存留的 10ul 0.1% TFA 上面。 6.通过注射器施加空气压力,把液体轻轻地推过层析柱。注意层析柱绝对不能干掉,在柱床的顶端要留有约 2ul 的溶液。 7.用 20ul 0.1% 的 TFA 清洗层析柱,让层析柱自然流尽。 8.用 0.5ul 的基质溶液,将分析物直接洗脱到 MALDI-MS 板上。这 0.5ul 的基质溶液应分为几滴(5~10 滴)点在板上。另外,分析物也可用 ESI-MS 分析,此时以甲醇/甲酸/水(50:1:49) 把多肽从层析柱中直接洗脱到毛细管喷针或者微量离心管中。
层析柱用 100% 乙腈彻底清洗后可以重复使用。层析柱可被重复利用 2~10 次而没有任何残留效应,这与层析柱的大小和装载到层析柱上的分析物的丰度/浓度有关。
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1.GELoader 移液吸头的尖端压扁。具体方法参见方案 2(图 8.32)。 2.将 100ul 50 mmol/L NH4HCO3(pH 7.8)加入约 3 mg 的树脂,用于制备固定化胰酶的树脂悬液。 固定化胰酶树脂的浓度应随着固定在树脂上的酶量而变化。 3.将悬液加到空的 GELoader 移液吸头(由步骤①制备)中,然后通过一个黄色移液器头将装有树脂的 GELoader 移液器头连接到合适的 Iml 注射器上,用注射器将悬液轻轻推到压扁的移液吸头尖端,制成一个层析柱。注意不能使层析柱干透。 黄色移液吸头必须被剪切两次,才能既适合注射器又适合 GELoader 移液吸头。NH4HCO3(50 mmol/L,pH7.8) 的最适 pH 值范围为 7.5 左右,可用于大部分蛋白酶。对于在其他最适 pH 范围和缓冲液条件下才能活化的酶,应考虑更换缓冲液。 4.每次用 30ul 的 NH4 HCO3 溶液(50 mmol/L,pH7.8) 清洗层析柱数次。在洗涤过程中严防层析柱干透。 也可以用含 10%(体积分数)乙腈的 50 mmol/LNH4 HCO3(PH7.8) 清洗层析柱。 5.将待酶解的蛋白质/多肽加到浸于 50 mmol/LNH4 HCO3 中的层析柱上。 6.利用注射器慢慢地、轻柔地将液体压过柱床,将流穿液收集到一个微量离心管中以备进一步分析。对于非常少量的蛋白质或肽段,或很稀的样品,可选择用反相微型层析柱进行蛋白质脱盐和浓缩(参见方案 2)。
7.如果穿透液中蛋白质或肽段的含量很低,或为了追求洗脱的完整性,可用 5ul 含 10% 乙腈的 50 mmol/LNH4 HCO3(pH7.8) 溶液洗脱层析柱,然后将洗脱液与穿透液合并。 8.如果蛋白质(0.02~0.05ug) 或肽段(0.001~0.005ug) 的回收量达到 pmol 级,将少量穿透液与 2% 甲酸及相应的基质在 MALDI 板上直接混合。如果样品的量太低,需用反相微型层析柱先将步骤⑥和步骤⑦回收的样品脱盐和浓缩,详见方案 2。
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一、微型毛细管层析柱的构建将一根聚酰亚胺毛细管的一端拉细至 5um 左右,其尖端可以起到过滤器的作用,同样也可以作为 ES1 的发射源。需在低分辨率显微镜下观察拉细的毛细管及填充的过程。 1.一根有聚酰亚胺涂层的 75um(内径)X 360um(外径)的毛细管上切下长 30 cm 的一段,用镊子夹住毛细管的一端,在丙烷喷灯上略为灼烧一下,以除去约 2~3 cm 的聚酰亚胺涂层。然后将这段毛细管拉尖。 2.将拉细的一端放到洗净的食指(用 70% 的乙醇冲洗)上,然后用毛细管切割器将细端切齐,然后在 70% 的乙醇中浸蘸一下。为了确保 ES1 的工作质量,应在一台低分辨率(5~10 倍放大)显微镜下观察尖端是否平齐(不能参差不齐),尖端是否内径约为 5pm。 毛细管人工拉细操作的关键是要耐心。人工拉细毛细管的替代办法是从 NewObject1ves 公司(Woburn,Massachusetts) 购买已拉尖的毛细管,或者从 Sutter1nstruments 公司(Novato,Cal1forn1a) 购买激光拉针器。 3.用平勺将 50~100ul(干体积)的 C18 衍生树脂放人 1.7 ml 的离心管中。
4.在 Cls 树脂中加人约 500ul 70% 的乙醇,混匀,然后进行短暂的超声处理(不超过 1 min)。
5.把装着悬液的试管放人压力室(图 8.33)。 处理装有悬液的小管时最好使用镊子。压力室的内膛有许多小孔,可以插人不同长度的试管,对于较短的试管,应在底部放一些 Ki mwipes 纸巾,以使装有悬液的试管在膛内能达到适于操作的高度。 可以调节溶剂的黏度以控制装柱速度。 6.将毛细管未拉细的钝端从压力室的顶端穿入,即穿过螺栓、Teflon 塑料套圈和压力室的顶部(图 8.33)。插人压力室内的毛细管的前端应位于 500Jul 悬液的中部。 从仪器上面可以观察到毛细管,当看到毛细管开始弯曲时,表明毛细管已经到达试管的底部,然后将毛细管向上拔大约 0.5 cm。关上压力室的顶部,并确保 O 形圈位于正确的位置,然后用内六角扳手拧紧 4 个螺栓。再将压力室顶部控制毛细管的螺母拧紧,以确保毛细管位置正确。
7.调节压力调节器(二级、高压)至 1OOOps1(即 6.9MPa)。此时,毛细管层析柱已可以进行填充。通过旋转阀门 180°,缓慢增加压力室内的压力。当毛细管被填充到 1Ocm 后停止操作,也可以填充整个毛细管柱。然后,修剪毛细管层析柱至合适的长度。 8.当达到 0.5~1.0 cm 的理想填充长度时,除去压力室的压力,移走悬液,代之以一管 0.lmol/L 乙酸。再将仪器密封,打开压力阀,冲洗毛细管直至流出液变酸 (用 pH 试纸检验)。尽管在毛细管后部仍有一些未填充的硅胶粒,至此填充过程即可结束。 9.将层析柱的末端放入充有 50% 甲醇的 15 ml 聚丙烯塑料管中,进行密封后可以无限期保存。 二、系统适应性测试LC-MS 系统装配完成后,应在分析宝贵的样品之前进行常规检测,以判断是否所有的部件都可以正常运行。如果使用相同条件对系统进行常规检测,而系统不符合要求,则可利用逻辑系统程序来纠正错误。因而,在使用 LC-MS 装置时,建议进行系统适应性检测,也就是对性质已知的样品进行分析。通常,最简单的样品是纯化的肽段,但也可以采用性质已知的其他任何样品。对于 LC-MS 系统来说,可以通过 4 个简单问题来评价系统的性能。以下将阐述应检测的系统参数。 1.质谱仪是否经过校准?通常是对比实测值和理论质量 [图 8.35(a)]。 2.HPLC 和 jlxLC(微型液相层析柱)是否正常运行?可比较实测的延迟时间和预期的延迟时间、检测 HPLC 的柱后压,以及通过单离子流图来计算单一分析物的峰宽 [图 8.35(c)]。 3.溶剂(和样品)干净吗?通过汇总洗脱峰的质量图谱,检测分析物洗脱峰处的信噪比 [图 8.35(b)]。由于静电和疏水性相互作用,分析物会携带一些性质不清的成分,这会降低信噪比;而过期的溶剂一般会增高噪声水平。 4.质谱仪是否经过正确调试?检测洗脱峰处的信噪比。因为质量图谱数据不是绝对的,所以检测信噪比比单纯检测信号更有意义。 在分析真正的样品之前,仅利用 LC-MS 分析的质谱数据就能够回答上述所有问题。为了给实验室内部或不同实验室之间的仪器提供性能比较的基础,最好标明所用系统的适应性测试条件。分析物应与完成分析和良好标定的测试物属于同一类型。例如,图 8.35 所示的数据来自 500fmol 的神经降压素,按照前面所述将其加入到 mLC 层析柱上,并用离子阱质谱仪分析。针对上述 4 个问题,对所获得的结果进行分析。 1.如果 HPLC 系统运行正常,能够按照程序传送溶剂,则肽段的洗脱时间应该可以重复。 2.如果洗脱时间超过预期范围,将导致或者 HPLC 系统不能按程序运行,或者层析柱失效。 3.如果峰形不对称或太宽(对 0.5~1.Opmol 的肽段标准品,应为大约 10~30s)(图 8.35),那么可能是填充物存在问题,或者是 uLC 层析柱的某处存在死体积。 4.如果 HPLC-MS 能够正常工作,那么分析物的信噪比就应该超过经验值。图 8.35c 举例说明了如何对此进行计算。为便于示范,纵坐标放大扩展到正常的 200 倍。通过扩展纵轴直至单电荷信号被噪声掩盖,以此来估计信噪比。如果分析物的信噪比低于可接受的值,那么或许应该改变溶剂,或者重新调试质谱仪,或者需要清洁离子聚焦的透镜。当透镜被一层薄不可见的物质(例如来自于重复分析的样品)覆盖时,施加的电压就不再等于离子正常通过时的场电压,因而导致仪器性能(例如信噪比)有所降低。 5.如果分析物的理论分子量和实际观察到的分子量在质谱仪容许的误差范围之夕卜,那么也许只是设备需要清洁,并在清洁后进行调试和校准。 遵循这些步骤将有助于初学者快速检修复杂的 LC-MS 设备。最佳灵敏度应该采用上样量为 5amol(10-18mol) 的标准肽段—这对于他们是一个挑战。 三、酵母裂解混合物的分析来自酵母全细胞裂解物的蛋白质可按照下列步骤进行胰酶酶解和 MS 分析前处理。 1.将酵母全细胞裂解物沉淀(含蛋白)重悬在 0.5 ml 的 50 mmol/L NH4HCO3(PH8.3) 和 0.5% SDS 溶液中,60°C 条件下孵育 30m1n,期间间断地涡旋振荡几次以使之溶解。得到的混合物用 50 mmol/LNH4 HCO3(PH8.3) 稀释,直至 SDS 浓度为 0.05%。按照酶:底物为 100:1 的比例加人修饰过的胰酶,37°C 孵育过夜。 2.在进行 LOMS 分析前,将得到的肽段用 OAS1S MCX Cartridge 进行纯化 (依仪器使用手册进行)。 3.将输送自 DIONEXFAMOS 自动加样器内酸化的肽段混合物加到孔 3(图 8.34) 相连的 C18 预柱,液流通过六通阀(孔 4) 直接流入废液缸。 4.用 100% 溶剂 A 清洗 5m1n 后,关闭转向阀,液流转向 10 cm X 75 um(内径) 的 pLC 层析柱(孔 1),该层析柱也作为 ES1 的喷针。在液流进入毛细管柱的同时,来自 Ag1lent1100 HPLC 的乙腈(溶剂 B) 线性梯度洗脱开始进行。为降低质谱的化学噪声,溶剂 B 中不能有酸。线性梯度从 2%~45%,梯度时间为 60m1n。泵的最初流速为 l00 ul/min。 5.在自动加样器和层析柱之间,接一个空的聚酰亚胺毛细管(其规格必须根据经验设置)作为分流器,图 8.34 所示装置的流速是 300nl/min。图 8.34 所示的 Up churchScientific 四通阀的孔径为 0.006 in(0.15 mm),该四通阀由位于 Thermo Finniigan ITMS 上的特殊装置(购自 Brechbuhler,inc.,Spring,Texas) 固定在恰当的位置。 6.对孔 2 施加高压以开始电喷雾。进行 C1D 的离子通过自动程序选择,即使用「自上而下」(top-down) 的数据依赖型离子选择方法对最强的三个离子进行 MS/MS,包括 3m1n 的动态排除时间,以阻止在整个 pLC-ES1-MS/MS 分析过程中已经选择过的离子被不断重复选择。 7.1ug 的复杂肽段混合物(通过测定的蛋白浓度进行估算),根据上述步骤进行 uLC 层析柱进行分离,洗脱的肽段利用离子阱质谱仪进行 C1D。分析装置如图 8.34 所示。 8.肽段离子在较宽的 m/z 范围(400~2000) 通过数据依赖型方法被选择出来进行 C1D,动态排除时间为 3 min,以阻止已经被 C1D 处理的高丰度离子被重新选择。 9.酵母蛋白通过其肽段的串联质谱谱图用 SEQUEST(Eng,etal,1994) 检索数据库,进行蛋白质鉴定。图 8.36 举例说明了实验所得到的一个典型的离子峰。 对样品重复进行 3 次 uLC-ES1-MS/MS 分析,鉴定出 401 种蛋白,要求所有正确匹配肽段的序列都具有与酶切特性一致的氨基和羧基末端,所使用的评分体系为已知能够正确鉴定蛋白的一套标准评分系统(Keller,2002)。图 8.36 所示为两个肽段的串联质谱图及两者的 SEQUESTXcorr 和 dcon~得分,鉴定结果表明两个肽段属于两个不同的蛋白。目前,即使是利用上述特定的标准,SEQUEST 的数据库搜索的结果还要进行人工判定,因为 SEQUEST 得分高的并不总是正确匹配的肽段序列。不过,在不远的将来,在使用 SEQUEST 或其他专用软件进行分析时,可在进行数据库搜索之前通过一些软件,例如 QSCORE(Moore,etal,2002),对串联质谱图按照质量好坏进行筛选,以增加数据库匹配的正确性。这种工具将大大提高专用系统处理海量数据的能力。
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一、纳升级液相色谱柱的制备1.在溶融石英毛细管(大约长 12~15in,即 0.3~0.38m,100um x 365um)的中间部位除去聚酰亚胺涂层。操作如下:将毛细管放在酒精灯的火焰上烤至聚酰亚胺表层烧焦 (见图 8.37),用蘸有甲醇的棉纸擦拭毛细管以除去烧焦的物质(见图 8.38)。 和酒精灯不同,本生灯的火焰太热,可致使毛细管内侧封堵,因此不适用。 2.将除去涂层的毛细管部位放人 P-2000 激光拉针器,拉制毛细管针 (图 8.39)。除去涂层的部位应放进拉针器的反射凹槽内,使激光在凹槽内聚焦,从而熔化硅化的毛细管。 拉针器镜子每个边的臂上都有凹槽和小钳,用以固定硅化的毛细管。表 8.11 列出了拉针器的一些参数,适用于将 100umX365um 的毛细管拉成尖端为约 3um 的喷针。 3.利用不锈钢增压瓶将 C18 反相层析填料装人拉好的毛细管针尖中。
(1)将大约 5 mg C18 反相填料放入一个 1.7 ml 的微型离心管中,然后加入约 Iml 甲醇。 晃动离心管使颗粒悬浮,然后将其放入增压瓶中。拧紧 5 个螺栓,确保增压瓶完全密封。 拧紧 5 个螺栓至为重要。增压瓶盖和增压瓶上都有与O形圈相配的凹槽,关紧增压瓶盖即可达到密封的效果。
(2)增压瓶盖上有一个接头卡套装置,其上有 Teflon 塑料密封套。将硅化的毛细管向下穿过塑料套圈直至其末端,到达微型离心管底部。拧紧塑料套圈,固定毛细管。图 8.40 所示为增压瓶和准备填充反相介质的微型毛细管。 (3)打开氦气瓶向增压瓶施加压力,调节压力计至约 400~800psi(2.76~5.52MPa),然后打开增压瓶上的阀门,向瓶内增压。 此时,填料介质开始填充针状毛细管,直至毛细管微型层析柱制备完毕。为了达到较好的层析分离效果,柱床应填充到 10?15 cm。 4.通过 Up church PEEK 微型四通阀,将针状毛细管连接到 HPLC 上。Up church 微型四通阀的连接布局参见图 8.41。 (1)四通阀的第一个连接点应连接来自 HPLC 泵的传输线。传输线由一根 50um X 365um 的熔融石英毛细管组成,长度应足以从 HPLC 泵到达质谱仪。 (2)第二个连接点与一根用作分流线的熔融石英毛细管连接。分流线将大量液流分流出去,从而降低通过毛细管微型层析柱的流速。这部分毛细管的尺寸和长度取决于来自泵的流速及微型层析柱的长度。最初可尝试使用 100um X 365um 的两叉出口的接头做分流线(请参照步骤⑥)。 (3)第三个连接点连接的是一段金线,通过该段金线将把施加在针状毛细管的溶剂的电压从0提高到 1800V,从而使电喷雾得以进行。 (4)第四个点连接的为已填充好的毛细管微型层析柱。 5.在加样前需要先平衡层析柱,即用 100% 的溶剂 A 置换甲醇,以 150ul/min 流速持续 5 min。 6.5 min 后,用带刻度的玻璃毛细管检测毛细管微型层析柱尖端的液流速度。尖端的理想流速应为约 100~300nl/min。如果流速超过这个值,用陶瓷划片切掉一段分流线毛细管,从而使更多的液体通过分流线流出,如此使较少的液体流过微型层析柱。如果流速低于 100 nl/min,则应使用更长的或更小内径的毛细管,以使更多的液体流过微型层析柱。 检测流速并调节分流线的操作可能会重复多次,直至达到理想流速。 二、样品的浓缩肽段样品可溶解在多种试剂中,其中包括 Tris、碳酸氢铵盐、乙酸、甲酸和尿素。然而,一般来说肽段样品是蛋白质或蛋白质混合物的酶解产物,其中可能会存在一些干扰反相层析和质谱测定性能的试剂(见后述步骤11 的实验提示)。 肽段样品体积可从几微升到 1 ml 或更多。微型层析柱的柱床体积大约为 1.54, 最多可允许 50ul 的样品直接加到层析柱上。若样品体积超过 50 沁,就必须浓缩样品 (详见步骤7~11)。 7.按照下面的操作程序,将 1 ml 甲醇润湿 SPEC Plus PT C18 固相抽提移液器头,推出最多一半的甲醇经过固定相盘面,等待 15~30s,以使盘面活化;再将剩下的甲醇推过盘面,整个过程都不能有空气进入移液吸头的 C18 固相层。 8.用 1ml 溶剂 A 推过盘面以平衡移液吸头。 9.将肽段溶液吸入移液吸头,再推回去。 这一步骤可重复 2~3 次。肽段会存留在移液吸头的 C18 固相层上,从而得到浓缩。弃去流穿液。 10.吸入约 100ul 的 90% 乙腈/0.5% 甲酸,洗脱肽段。将洗脱液推过 C18 固相层,再通过 C18 固相层吸回溶液,然后再推出,从而使洗脱液三次通过 C18 固相层。 11.用真空干燥器除去乙腈,直至肽段完全干燥。将肽段重悬在 10~15ul 的 5% 乙腈/5% 甲酸中。经此处理后,样品即可加到微型毛细管反相层析柱上。
一旦去垢剂进入层析柱,它将与反相填料结合,并在梯度洗脱时同样被洗脱下来,干扰后面的分析过程。去垢剂比肽段更易离子化,因而会掩盖肽段离子。如果肽段样品中包含尿素、甘油或蔗糖等试剂,则会因溶液很黏而给上样带来一些困难。这种情况下一旦上样,则应在梯度洗脱之前,用 100% 溶剂 A 充分淋洗层析柱以除去这些化学物质。 三、将样品加到 C18 层析柱上12.将样品 14000r/min 离心 IOmin, 使所有固相物质沉淀。 13.如果有沉淀,将上清(肽段样品)转移到另一个离心管中。即使是很微量的固体物质也会堵塞层析柱,应予注意。将装有肽段的离心管放入增压瓶,拧紧瓶盖 (拧紧压力瓶盖的操作,参见步骤③a.)。 14.将反相毛细管微型层析柱穿过 Teflon 塑料套圈,直至到达离心管的底部。拧紧塑料套圈,以固定微型毛细管层析柱。 15.将气罐上的压力计设置到 400~800psi(2.76~5.52MPa),然后打开增压瓶上与气罐相连的阀门向增压瓶施压。肽段样品开始流入层析柱。 16.用带刻度的玻璃毛细管检测针状毛细管尖端的上样量。 17.当上样量达到 8~10ul 时,释放压力,然后把层析柱从增压瓶中取出,重新接回到 Upchurch 四通阀上。 四、离子源装置18.将连接好的 Upchurch 四通放到一个平台上,该平台是专门为 ThermofinniganLCQ 系列质谱仪设计的,具有三个功能: (1)放置微型四通,并使之固定在正确位置; (2)当微型四通带有高电压时,可使四通与周围环境绝缘; (3)通过 XYZ 操纵仪,可调整微型层析柱相对于质谱仪人口(加热的毛细管)的位置。 图 8.42 所示的平台包括有机玻璃支持板、微型四通、高电压接头、微型层析柱和质谱仪入口。塑料板上带有 Teflon 塑料螺丝,用来固定各种连接。 位于有机玻璃支持板上的铝质接线柱连有绝缘电缆,可向四通和微型层析柱的溶液施加 1800V 的高压。塑料板可向下压紧,使金线压到铝质接线柱上,使得只有微型四通接有电源,而 XYZ 操纵仪或金属支持物不被接电。 19.使用 XYZ 操纵仪调整微型层析柱的位置,使得毛细管针尖与质谱仪的加热毛细管相距 2~5 mm,电压设为 1.5~1.8kV。 五、HPLC 程序
六、串联质谱分析
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实验步骤 | ##一、用于MuDPlT 分析的可溶性蛋白提取物的消化 1.用 1 mol/L NH4HCO3将蛋白提取物的pH值调至8.5。测定蛋白质浓度(该浓度可作为参考,以确定在步骤⑤和步骤⑦所需要加人的蛋白酶量)。 2.向蛋白提取物中加入固体尿素,至终浓度为8mol/L。 3.向蛋白溶液中加入DTT至终浓度lmmol/L,50°C赙育20 min。 4.将已变性的蛋白溶液冷却至室温,加入碘乙酰胺至终浓度为10 mmol/L,室温避光孵育20 min。 5.加入内切蛋白酶Lys-C,使底物:酶的比例为100:1,于37℃衅育过夜。 6.用100 mmol/L(pH8.5)NH4 HC03稀释样品至尿素浓度为2mol/L, 加入CaCl2至终浓度为lmmol/L。 7.任选下面两种方法之一,将蛋白混合物进行胰酶消化。 ###方法A: (1)加人胰酶,至底物:胰酶为50:1,37°C孵育过夜。 (2)在微量离心管中以最髙速度离心,除去不溶性物质。 (3)转移上清至新的离心管中。 ###方法B: (1)每 50ug 蛋白样品中加人约 1ul Porosyzme-固定化胰酶,37°c孵育轻摇过夜。 (2)在微量离心管中以最高速度离心,除去不溶性物质。 (3)转移上清至新的离心管中。 方法B的优点是可减少蛋白样品中的胰酶污染,有利于后续分析。 8.参照使用说明书,将上清加到 SPEC Plus PT C18固相抽提柱上。将上清用5% 乙腈/0.5% 乙酸置换。 本步骤很重要,可除去多肽混合物缓冲液中与ESI-MS/MS不相容的盐成分(如NH4HCO3和尿素等)。从样品中除盐非常关键,因为盐可阻止多肽与2D柱中强离子交换树脂的结合,从而使多肽在未与离子交换树脂结合的情况下直接与反相填料结合,结果使 2D-LC 实际上成为一维反相柱。 通过人为控制,可使多肽中的盐从阳离子交换柱转移到反相介质中。含有 1mol/L 盐的样品无法进行 MuDPIT分析。另外,该抽提柱可用于浓缩样品,这同样重要,因为加入 15ul 的样品到 2D 微型层析柱上约需要 1.5 h。 ##二、MuDPIT |
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仪器、耗材 | |
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一、可溶性酵母蛋白的酶解1.将 1mg 冷冻干燥的可溶性酵母蛋白加入0.5 ml 的变性溶液中,37°C 溶解 15 min。 2.加入 IAA 至终浓度为 50 mmol/L,然后将样品置于暗处 30 mm,室温条件下使半胱氨酸残基烷基化。 3.样品透析:将样品溶液在 100 ml 的透析液中室温透析 lh,以除去盐和低分子量物质。 4.更换透析液,重复步骤③两次。 5.向样品中加人 20ug 胰酶,37°C 孵育 lOmin。 6.用 10 mmol/L Tris-Cl(pH8.5) 将样品稀释 2 倍(至 1.Oml),加入 CaCl2 至终浓度为 1mmol/L。用 pH 试纸验证 pH 值是否在 8 到 9 之间。 若变性液中含 SDS(步骤①),则必须使其在样品液中的终浓度低于 0.1%,以便胰酶有效消化。 7.37°C 条件下胰酶消化过夜。 8.用 2ul 的 TFA 酸化样品以终止消化,用 pH 试纸确证溶液 pH 值低于 3。 也可用其他方法来溶解(步骤①)和消化蛋白质(例如可不加 SDS,使用其他还原剂,若盐浓度很低则不用透析等)。不过在用 SCX 色谱进行多肽分离前,盐终浓度一定要低于 20 mmol/L(包括 Tris-HCl 和蛋白质水解产生的盐),且上样前需确保溶液的 pH<3。若盐浓度高于 20_〇 1/L,可用膜透析(见步骤③和④),或依制造商提供的指导用 Ql8 固相抽提(SPE) 柱(Vydac) 除盐。 二、SCX 色谱柱的准备9.以 SCX 缓冲液和 SCX 色谱柱为基础建立 HPLC 系统。 10.设置柱流速为 200ul/min,获得空白梯度。 用于多肽洗脱的缓冲液 B 在约 5%~35% 的区间应采取平缓梯度(见表 8.12),这样可使净电荷为+2 的多肽片段(为胰酶酶解的主要产物)比线性梯度洗脱有更好的分离效果。 11.检测 SCX 柱的性能 (1)将溶于缓冲液 A 中的 200pmol 多肽标准品加至 SCX 柱上。 (2)用 UV 检测仪检测多肽在 214nm 的吸收。 应能获得 6 个完全分离的且峰宽小于 1min 的洗脱峰。 三、SCX 色谱分离酵母肽混合物12.将酸化的(pH<3) 的酵母酶解多肽样品加到柱上,用缓冲液 A 洗柱 5~10min,直至 UV 检测峰返回基线。 13.开始梯度洗脱,每分钟收集 200ul 洗脱组分。 图 8.44 所示为利用该技术分离 Img 酵母蛋白的洗脱图谱。该技术可以分离多达 5 mg 的多肽,可根据样品量选用更大或更小的柱子。 14通过离心蒸发浓缩样品体积至 50~100ul。 四、SCX 色谱分离组分的 RPC 层析将纳升级的反相色谱毛细管 LC 串联离子阱质谱仪,进行在线检测,其灵敏度最大,可鉴定的多肽最多。串联后,多肽的检测水平可达 1~5 fmol,并且串联质谱的获取速度达 2000 个图谱/h。 15.将一支内径 75 um、长 20 cm 的桂化毛细管拉成针尖。 有很多方法可用于拉制电喷雾的细针。最简单的方法是将一重物(用胶带纸)粘在针上,然后用微火焰将毛细管拉尖。另外,在方案 5 中介绍的激光拉针器也很有效。不过,拉好的针或预装柱也可以买到(例如,NewObjective,Cambridge,Massachusetts)。 16.取一根已拉尖的 75 um 的硅化毛细管,其中填充 5um、200A 的 C18 颗粒,柱床长度 12 cm(填充毛细管的方法详见方案 4 或方案 5)。 毛细管的针尖不仅可以填料,而且还可充当 MS 的电喷雾针。 17.按照下列步骤连接微型四通的 4 个臂: (1)来自 HPLC 的流动相(lOOjul/min); (2)用于分流(50ym 内径 X50 cm) 的限流毛细管;流速 99.7ul/min; (3)一根连接到高压电源(1.8kV) 的金导线; (4)拉尖的纳升级反相毛细管柱(步骤?),流速为 300nl/min。 18.将 HPLC 的流速调至 100u1/min,利用微型四通进行分流,使流向反相层析柱的流速为 300nl/min。 19.取经 SCX 色谱分离的组分 50ul, 离线加压上样(pressure-loadoff-line),每次加样 10 ul 或更多,然后进行梯度洗脱。 20.向 ESI 提交洗脱峰并在离子阱质谱中分析。 MS 以两种模式运行,即 MS 模式(测定多肽离子的 m/z) 和 MS/MS 模式(多肽测序)。 在短短的 1 h 的反相 LC-MS/MS 分析中,数据依赖型的 MS/MS 扫描可进行上千次肽段测序,将从 MS 扫描中所选择测序的多肽设定为「on the fly」,从每个 MS 图谱中选择 5 个肽段进行测序(裂解)。
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实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
一、变性、还原和缓冲液置换1.在真空干燥器中浓缩 120 ug 混合蛋白样品,直至完全干燥。 2.将蛋白样品重新溶解在约 1ml 变性/还原缓冲液中,37°C 孵育 30 min,使样品变性还原。 体积不掃要非常精确,因为在下一步操作中缓冲液还需置换。不过样品体积越小,需要置换的时间就越短。 3.除去还原剂,降低尿素浓度以及除去缓冲液中的干扰成分。用约 4 ml 生物素化/胰酶消化缓冲液置换原液,在 Centricon YM-3 浓缩管中进行(4°C 离心)。 二、标记 Biotin-HPDP 和缓冲液置换4.标记所有自由巯基。加入 50ul 4 mmol/L Biotin-HPDP(溶于 DMSO 中)到样品中(第③步操作后样品体积约为 1ml),室温孵育标记混合物 90 min。 由于不确定标记反应是否能在 2mol/L 尿素存在的情况下有效进行, 所以可加人过量的 Biotin-HPDP。Biotin-HPDP 的量应大于亲和柱的结合能力(理论上,Img 抗生物素蛋白可结合 59nmol 的生物素)。 5.用新鲜的生物素/胰酶消化缓冲液置换原液,以除去未结合的 Biotin-HPDP。 置换在 CentriconYM-3 浓缩管中进行(4°C 离心)。 未结合的 Biotin-HPDP 会与生物素化的多肽竞争结合抗生物素蛋白。 第③步用过的 CentriconYM-3 浓缩管可在这一步重复使用。 三、标记后蛋白混合物的消化6.加 1.5ug 胰酶到生物素化的样品中,孵育消化过夜(37°C)。 7.用 PBS(含 1mmol/L EDTA) 稀释样品消化产物,使尿素浓度降到0.5 mol/L 以下。 如果在几个小时内就用于抗生物素亲和柱,样品则可以在室温、4°C 或冰冻保存。若需要留存更长时间,则保存在-80°C。 四、固定化抗生物素亲和柱捕获及洗脱8.用 5 ml PBS(含 lmmol/LEDTA) 平衡 1ml 固定化抗生物素亲和柱。 9.将消化后的样品(来自第⑦步)加到亲和柱上,封闭亲和柱,室温孵育 30 min。注意不要让柱子变干。 10.为收集不含半胱氨酸的多肽,用 10 ml PBS(含 1mmol/LEDTA) 淋洗柱子,并收集洗脱液。这样可获得穿透组分。 11.从固定化抗生物素亲和柱上洗脱含半胱氨酸的多肽。 (1)加 2 ml 含 50 mmol/LDTT(现用现加)的 PBS 到柱子上,使其进入柱子。 (2)封闭柱子,室温孵育 30 min。 (3)打开柱子,收集 2 ml 洗脱液,得到结合组分。 五、烷基化和除盐12.如果要进行 LC-MS/MS 分析,需用 IAA(分别为 10 mmol/L 和 100 mmol/L) 对穿透组分和结合组分分别进行烷基化,避光室温作用 30 min。 13.用 90% 甲酸酸化肽段(分别加 20 沁到结合组分,IOOiLd 到穿透组分),使甲酸终浓度为 1%。在脱盐前一直将样品保存在-80°C。 14.根据厂商提供的使用说明,在 LC-MS/MS 之前用 Oasis HLB 抽提柱(或类似设备)对各个组分进行脱盐。
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实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | |
实验步骤 |
第一阶段 ICAT 标记蛋白 第二阶段 阳离子交换清洗 ICAT 样品 第四阶段 ICAT 标记多肽的质谱分析
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实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
一、培养细胞 二、提取蛋白的细胞准备
三、蛋白质提取
四、蛋白质分离 五、胶内酶解
六、蛋白质质谱分析
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试剂、试剂盒 | |
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仪器、耗材 | |
实验步骤 |
一、ST-Sepharose 亲和树脂的制备 二、脱水胰酶的制备
三、脱水胰酶亲和柱的制备 四、样品制备、加样和洗脱
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实验方法原理 | , |
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试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
一、IAV-胰酶膜的制备
二、固定化胰酶活性的检测
三、凝胶电泳分离蛋白质 四、胶的染色
五、蛋白质双平行消化
六、膜结合蛋白的染色(本步骤为选做)将 PVDF 膜用 0.5% 的氨基黑染色 1 mm,然后用水脱色。 七、PMF 数据的采集
八、蛋白质的鉴定1.使用质谱仪的采集软件,设置质量峰的检测阈值,该值是针对一组校准过的图谱而优化获得的(相应标准参见表 8.9 和表 8.10)。然后将 MALDI 板上的位置转换成相应的表观分子量(Mr) 和等电点(pI)。 已经开发出了使鉴定过程自动化的工具(Gras,et al,1999;Perkins,et al,1999)。 2.整合 PMF 及计算出的表观分子量、等电点等数据,并设置相应的肽质量误差 711 围和化学修饰参数,然后将整合的所有数据自动提交到 SmartIdent(http://ch.expasy.org./tools/)。 鉴定过程必须考虑到弱表达的蛋白质及重叠的蛋白质斑点,因此 PMF 搜索的最小肽段匹配数应该尽可能少(即 3 个肽段)。未酶切位点设为 1。在任何情况下,那些带有未酶切位点的肽段或有人工修饰(如丙酰胺半胱氨基,proionamidecysteine) 的肽段,对最终得分的贡献都少于那些没有未酶切位点和未修饰的肽段。众所周知,MALDI 样品板上的质谱采集位点影响质量的准确性(Egelhofer,etal,2000)。此外,粘到 MALDI 板上的膜的微弱翘曲也会导致误差。所以,预期的质量误差会高达〇.6Da,通常这不至于影响蛋白质的鉴定,因为 SmartIdent 工具通常能够对校对误差给予补偿。 3.将质量峰列表和鉴定结果转换成 text 文件。 九、建立真实图像按照 Bienvenut 等(2001) 介绍的程序分析归类所鉴定的蛋白质。以下一些标准可用于从鉴定结果中找出、排除错误结果: (1)同一种蛋白质的鉴定结果应该集中在 2D 凝胶上的某一点的区域范围内,因此,如果鉴定结果分数在膜的一个比较大的区域,则应该予以排除。 (2)鉴定结果需要基质峰或污染峰相匹配的,则其结果应予排除;同样,弱表达的蛋白质鉴定时,如果匹配的是高丰度蛋白质的肽段,则也应排除。 (3)平均得分低的鉴定结果必须舍弃
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实验材料 | |
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试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 |
一、样品的 2DPAGE 和电印迹1.将细胞或蛋白质样品悬浮于变性缓冲液中,至浓度为 3 mg/ml,室温孵育 2 h。 2.必要时,室温条件下用 3 mmol/LTBP(以 20 mmol/L 的储存液稀释至工作浓度)还原蛋白质样品 2 h。 3.加入碘乙酰胺使蛋白质烷基化,室温条件下避光孵育 lh。 4.4°C 条件下,21000 g 离心 5 min。 5.取 115W 上清液,加到 7 cm 的 IPG 胶条上,室温条件下水化 4 h。 6.依照第 4 章方案 5(方法 A) 的步骤,进行等电聚焦(第一向分离)。整个电泳分离过程需要 36000V?h。 7.在等电聚焦平衡缓冲液中平衡胶条 20 min。 8.依照第 4 章方案 7 配制第二向 SEiS-PAGE 电泳胶。 9.依照第 4 章方案 8 的步骤处理蛋白质样品,以备第二向的 SDS-PAGE 分离。 10.将 IPG 胶条加到 4%~12% 的微型 SDS-PAGE 凝胶的顶部,依照第 4 章方案 9 进行第二向电泳。 11.依照第 4 章的方案 15 或方案 16 的步骤,电泳后以 400mA 转移 1.3 h,将蛋白质从胶上转移至 Immobilon-Psq 膜上。 12.用直接蓝-71 染色(见 Hong,etal,2000)。 13.真空干燥,然后将膜保存于密封的塑料袋中以防角蛋白污染。 二、化学打印膜的制备14.用导电胶带(3M) 将干燥的膜粘到 MALDI 板上。 15.用离线扫描仪采集已粘到 MALDI 板上的转膜蛋白的图谱。 16.利用局部分割图像分析算法自动或用「pointandclick」方法手动检测图像上的蛋白点。 该质谱仪(ShimadzuBiotech) 带有相应的软件。 17.为在化学印刷仪上标记 MALDI 膜的相对位置,如图 8.48 选择 3 个点进行标记,用数码相机 XY 坐标定位蛋白,计算其精确位置。 三、蛋白质点的膜上自动酶解18.编辑化学打印仪的程序,使之向膜表面自动喷洒 1%(体积分数)OGP,每个蛋白点约 1.5nl(15 滴),重复三次(总体积相当于 4.5nl)。 使用非离子去垢剂 OGP 可以确保 PVDF 膜表面的湿润,也可以作为封闭剂减少 PVDF 膜对蛋白质内切酶的吸附。 编辑化学打印仪的程序,喷洒 1nl(10 滴)200ng/ul 的膜酶(溶于 25 mmol/LNH4 HCO3) 到已覆盖 OGP 的膜表面,重复 50 次(终体积为 50nl)。如此,每个蛋白点上约有 10 ng 胰酶。 对于需以喷洒两种蛋白内切酶的同一蛋白点采集 PMF 数据的实验,则应喷洒 lg/L 聚乙烯吡咯烷酮/50%(体积分数)甲醇,每次 60 滴。 19.将印刷完毕的膜放人湿盒中,37°C 孵育 3 h。 20.酶解后,将膜重新放人化学打印仪。 21.向基质溶液中加入 50fmoles/ul ACTH。 四、MALDI-TOF-MS 分析 22.将 PVDF 膜(粘在 MALDI 板上)放人质谱仪中,然后利用 Axima-CFR 的软件 AScii2plate,将与喷涂位置相对应的坐标数据转换为 Axima-CFR 的平台定位文件 [见图 8.49(a),(b)]。 23.以正离子模式采集质量图谱。多肽离子化所用光源为 337nm 的氮激光,时间延迟提取脉冲加速电压为 25kV。 对于在某一位置内所采集的所有图谱来说,膜表面平整与否对其质量没有影响 [见图 8.49(C)]。 24.对样品的激光平均轰击次数为 50~100 次。以胰酶自酶解片段(单同位素质量为 842.51Da) 和 ACTH 肽(单同位素质量为 2465.19Da) 为标准,进行两点内标校正。 25.利用峰采集程序(Breen,etal,2000) 采集单同位素峰数据,使用 PMF 搜索引擎(该引擎搜索GenBank,www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html) 或 ExPASyPeptIdent(www.expasy.ch) 来鉴定蛋白质。
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