实验方法原理 |
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实验步骤 |
干细胞向成体动物体内移植—NOD/SCID 小鼠造血干/祖细胞移植基 本 原 理S C I D 小鼠为一种先天性 T 、B 细胞双重免疫缺陷动物。S C I D 小鼠由美国学者 Bosma1983 年首先发现于 C.B /17 近交系小鼠,是 由 位 于 16 号 染 色 体 的 隐 性 基 因 突 变 所 致 。纯 合 基 因 突 变 导 致 了 淋 巴 细 胞 抗 原 受 体 基 因 V 、 D 、 J编码的重组酶活性异常,使抗原 受 体基因 V 、 D 、J不能正常重排, T 、 B 淋巴细胞不能分化为功能性淋巴细胞,使得细胞免疫、体液免疫均缺陷,但该小鼠非淋巴性造血细胞分化不受影响,巨噬细胞、粒细胞、巨核细胞、红细胞、 N K 细胞均呈正常状态,骨髓造血微环境和胸腺基质也正常。另外, 基因突变也影响了该种小鼠的 D N A 修复系统,使其组织器官对电离辐射高度敏感而不能修复 D N A 的断裂。 N O D /S C I D 小鼠是用 S C I D 小鼠与 N O D /LtSz 系非肥胖性糖尿病 (non obese diabetic)小鼠回交产生的后代。它 既 存 在 基 因 突 变 引 起 的 T 、 B 细胞缺乏,又存 在 W O D 突变引 起 的 N K 细胞活性下降,补体和巨噬细胞功能缺陷, N O D /S C I D 小 鼠 比 S C I D 小鼠残留的免疫功能更少。而 且 N O D /S C I D 小鼠因为*SC/Z) 突变缺乏 T 细 胞 和 B 细胞免疫而不会发生自身免疫性糖尿病。因此,利 用 N O D /S C I D 小鼠进行干细胞移植具有完整的免疫缺陷,不易发生免疫排斥,能高效的移植异体干细胞,又有足够长的寿命完成移植后的观测。 N O D /S C I D 小鼠已成为当前干细胞移植、干细胞体内增殖分化研究中最常用的动物模型。其经典的实验莫过于向亚致死剂量照射的 N O D /S C I D 小鼠体内移植入外周血造血干/祖细胞,研究其造血重建功能。 主 要 设 备 与 试 剂仪 器 设 备 二氧化碳孵箱、荧光倒置显微镜、恒温离心机、 - 7 0℃超低温冰箱、高速低温离心机^ P C R 仪 、流式细胞仪、数码照相机、酶标仪、超净工作台、电泳仪、恒温水槽、台式高速离心机、普通光学显微镜、倒置显微镜、电子分析天平、恒温振荡器、 -20℃ :卧式低温冰柜、冰冻切片机、组织切片机、钴 源 6 GC o 、微型琼脂糖电泳槽。 主 要 试 剂 P C R 试 剂 盒 和 R T -P C R 试剂盒; 1 〇〇 bp D N A marker 曝呤霉素 (puromycin) ; 聚凝胺(polybrene)C D 45-PerCP/C D 3-FITC/C D 4-P E 三色荧光标记抗体、 C D 3-F I T C 突光标记抗体、 实 验 动 物 N O D /SCID 小 鼠 , 6〜 8 周 龄 ,体 重 18——20 g ,雌 性 ;三级动物饲养环境;笼具、垫料、饲料及饮水均高压灭菌,每周更换 2 次。饮水酸化。 操 作 步 骤 动 物 预 处 理 (2) 动物照射:细 胞 移 植 前 1 天 ,将小鼠放入经无菌处理的照射盒中,给予总剂量为 2. 5 G y 的 60 C〇-γ全身照射,剂量 率 为 2 〇 cGy/min; 照射结束后无菌条件下将小鼠转入动物房。 造 血 干 细 胞 移 植 ⑴ 小 鼠 照 射 后 12〜 2 4 h , 按 照 2xl07 个/只、 (2)观察小鼠存活情况,每周测小鼠体重,取尾静脉血,测定小鼠外周血中人CD45+ ,CD3+ ,CD4+ 细胞的比例; ⑶ 移植后 6 周 ,断颈处死小鼠前,取肝脏、脾 、骨髓制备细胞悬液, 4 % 多聚甲醛固定,流式细胞仪检测;4% 多聚甲酵固定液:称取多聚甲酸兔 加 入 腦 〇 ml 的容量瓶中,先 加 入 〇.lmol/LPBS 力 0 ml,放入磁力搅拌棒,加 Na 〇 H 助溶,调 整 容 量 至 腦 誠 ,调 整 p H 至 7. 4 。 外 周 血 流 式 细 胞 仪 检 测 方 法 .(1) 无菌环境下,每 只 E p 管中分别加入 2 0 ul肝素 (125U /ul) 用于抗凝,经尾静脉取血 5 0 ul ,颠倒混勻; ⑵ 每 只 E p 管中分别加人 1 〇ul 抗 cD45/CD3/CD4 抗体;室温 ,避 光 孵 育 20 min; (3) 加入红细胞裂解液,室温避光孵育 15 min; (4) 用 PBS 洗 涤 2 次 ,轻柔重悬,使终体积为 300 ul; (5) 上机测定。 4各 器 官 细 胞悬 液 制 备 及 流 式 细 胞 仪 检 测 方 法⑴ 移 植 后 存 活 6 周 的 N O D /S C I D 小鼠经颈椎脱臼法处死后,于 7 5 % 乙醇中浸泡3 min 后 ,置超净工作台内,无菌条件下,快速切取部分肝脏、脾 ,游离股骨。 (2) 肝脏、脾 组 织 在 180〜2 0 0 目不锈钢网上研磨过滤,经 4 号针头 ( 或 — 次 性 无 菌 lml注射器) 过滤,制备单细胞悬液。 (3) 股骨游离后,从两端关节处剪断,经注射器冲洗,同样针头过滤,制备骨髓单细胞悬液。 ⑷ 在 骨 髓 、外周血、肝 脏 、脾脏各细胞悬液中加入红细胞裂解液以裂解红细胞,室温避光孵育 15 min。 (5) P B S 洗漆, 70 哗 尼 龙 网 过 滤 后 ,轻柔重悬。 (6) 每只管中分另 Ij 加 人 1 0 0 抗 C D 45/C D 3/C D 4 抗体;室温避光孵育 2 〇 min。 (7) P B S 洗 涤 ,重悬,终 体 积 300ul。 (8) 上机检测。 NOD/SC ID 小 鼠 骨 髓 中 人 CD4 5 + 细 胞 的 RT-P C R 检 测 (两 步 法 ) :1 ) 细 胞 R N A 抽提 (1) 冲洗小鼠股骨中的细胞,每 5xl06〜 IOxlO6 个细胞加入 ImI Trizol 试剂。 (2) 将 细 胞 并 Trizol 试 剂 一 起 移 入 1.5m l 离心管中,室温 静 置 5 min; 使核°蛋白体完全解离。 (3) 加入〇.2 ml 氯仿,颠倒混匀,剧 烈 振 荡 15s,室温静置 5min。 (4) 4 ℃ 、 10 000〜12 000 g离心 15min。 (5) 小 心 将 上 层 水 相 (约 60%) 移 至 1.5 ml E p 管中,再 加人 500 ul异丙醇,振荡混勻,室 温 20 min。 (6) 4 ℃ 、: 12 OOOg 离 心 IOmin , 凝胶样沉淀物为 R N A 。 (7) 吸弃上清,并 用 Iml 7 5 % 乙醇洗涤 R N A 沉 淀 1 次。 (8) 4 ℃、 7500 g 离心 IOmin0 (9) 晾干沉淀,加 入 50^1 纯水溶解 R N A 沉 淀 , -70℃ 冰箱冻存备用。 2 ) 逆转录反应 ⑴ 细 胞 总 R N A 2 ug + Oligo dT 0.5ug,补水至终体积 10ul,90℃ 加 热 5 min,冰上骤冷。 (2) 反应体系: 结 果 判 断利 用 NOD/SCID 小鼠联合免疫缺陷的特点,在经亚致死剂量照射摧毁体内造血能力 后 ,移植异体造血干细胞,可在外周血中检测到供体来源的血细胞;在小鼠各脏器内可见局灶性组织增生,多系造血细胞增殖,主要由红系、粒 系 、巨核细胞系组成。其检测可利用外源细胞的标记,如人白细胞 CD4 5 , 或雄性个体 Y 染 色 体 上 的 基 因等标记。 通过本实验可初步证明植入的造血干/祖 细 胞 在 NOD/SCID 小鼠体内的造血重建能力 ;进一步的实验可选择优化植入步骤,增加移植效率作为切入点,为临床应用提供理论支持。 注 意 事 项(1) NOD/SOD 小鼠为联合免疫缺陷,抵抗力极弱,在伺养过程中要注意无菌操作,避免感染而导致的动物死亡;另外,受抗原刺激后的小鼠可能会增加其 N K 细胞的活性,降低移植效率。 (2) 照射剂量的把握是实验的关键,过量照射容易导致动物早期死亡率的增加,影响结果的观测。 (3) 植入细胞的数量也是需要重视的地方,植入细胞数目舍少会给后期的检测带来困难 ;而较多的细胞植入又可能会带来移植物抗宿主反应 (graft-versus-host disease,GVHD) ⑷ NOD/SCID 小鼠因体内免疫缺陷,体内自发成瘤较高,成活时间大多在 1 年左右 ,对于长期的体内植入实验有一定的限制。射 前 2 周 ,饮水加抗生素:新 霉 素 lg/L ,多黏菌素 B 106U/l,
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注意事项 |
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实验步骤 |
干细胞向动物胚胎移植一 胚胎干细胞嚢胚植入构建嵌合体基 本 原 理在研究干细胞的全能性方面,最能说明问题的实验就是嵌合体的构建,利用在囊胚期动物的免疫能力尚未发育的特点,将干细胞移植到动物的囊胚中,形成聚合胚,然后发育为成熟个体,干细胞来源的细胞参与动物个体各胚层的分化,组织器官的构成,从而可以说明干细胞具有分化为全身各种细胞的能力。 目前具有这种能力的主要是胚胎干细胞 (E S 细胞)。在 2 0 世 纪 7 0 年代以来,人们已先后获得了大鼠、兔 、羊 、牛 、猪等的嵌合体。 本节主要介绍利用胚胎干细胞构建人鼠嵌合体的步骤,这将为今后通过构建嵌合体来 鉴 定 E S 细胞系或利用基因修饰 E S 细胞途径而获得转基因动物奠定基础。 主 要 设 备 与 试 剂实 验 动 物 实验小鼠,二级。 6——8 周 龄 ,体 重 24——45 g , 饲 养 室 温 18〜 2 5 1 ,黑夜白昼时间各12 h . 主 要 试 剂 仪 器 设 备 解剖显微镜、倒置显微镜、体视显微镜、倒置相差显微镜、纤维光学入射光源、显微操作仪、显微注射操作系统、显微镜温控仪、拉针器、微锻炉、磨针器、电热鼓风干燥箱、冰藏冷冻箱、蒸汽消毒器、电热恒温板、电子天平、自动搅拌器、二氧化碳培养箱 、超净工作台、离心机、液氮罐、-70℃丈冰箱、超纯水装置。 现配现用。 操 作 步 骤小 鼠 胚 胎 成 纤 维 细 胞 的 分 离 与 培 养 1 ) 小鼠胚胎成纤维细胞的分离 2 ) 胎鼠成纤维细胞的传代 (1) 吸弃瓶中旧细胞培养液。 3 ) 小鼠胚胎成纤维细胞的冻存 (1) 细胞消化操作同传代。 4 ) 小鼠胚胎成纤维细胞的复苏 (1) 依照实验安排及所需的细胞数量计划所要复苏细胞的多少。 注意:在细胞冻存复苏过程中,一般的原则是慢冻快融。 5 ) 小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备 ⑴ 选 择 铺 满 75c m 2 细胞培养瓶底的 2——4 代小鼠胚胎成纤维细胞,吸弃旧培养液。 胚 胎 干 细 胞 (E S ) 的 传 代 培 养 I) E S 细胞传代培养 2) E S 细胞的冻存保种及复苏 方法同小鼠胚胎成纤维细胞的冻存及复苏。 3 ) 注 射 前 E S 细胞的预处理 注射 用 E S 细胞于注射前日以 1 : 2 传代,常规消化制成单细胞悬液,接种于预先涂 小 鼠 胚 胎 的 收 集 及 培 养 1) 操作液 ⑴ 小 鼠 冲 胚 液 : M 2 液。 2) 囊胚的获取 适 用 于 12 h 照明-12 h 黑暗的循环饲养环境 (7: 〇〇 和 19:00 改变照明)。 3) 嚢 胚 的 培 养 用 M 2 液将冲出来的胚胎洗 3〜 8 遍后 ,用玻璃管拉制的移卵针将其转移到用石蜡油覆盖的囊胚培养液液滴中, 胚胎培养 用 6 0 mmxl5m m 的培养皿,在 每 50ul的培养液滴中放入约 10 个胚胎,然后把 (2) 断 针 :将拉好的针垂直固定在显微锻针仪上,预先在铂金丝上做一玻璃珠,将铂金丝移至毛细管内径 10〜 15um 的部位,并与针管壁接触,加热铂金丝上玻璃珠至所需温 度 ,即针壁与电热丝黏连时,停止加热,针管自动断裂。观察断口是否整齐,若整齐可留用;若不整齐,可再断一次。 2 ) 扶持针的制作 ⑴ 拉 针 :如同拉制普通的玻璃吸管一样,双手握住外径为 1.0——1.5 mm 的厚壁毛细管的两端,将中部在微小酒精灯火焰上烧烤并两手不停旋转,待毛细管变软时,将毛细管移离火焰,同时迅速向两边拉出 5——10 cm。 3 ) 移胚管的制作 与制作扶持针的过程相似,移胚管一般用普通的 B D H 硬玻璃吸管在酒精灯上烧制而成。即其在酒精灯上烧的同时两手需不停转动,待玻璃吸管变软时将玻璃管移开火焰的同时迅速再向两边拉出 5〜 10c m ,用砂轮切断使内径为 130〜180 um,外 径 为 200 啤 左右 ,即 大 于 1 个胚胎而小于 2 个胚胎。移胚管开口处需加热处理成平滑钝口,目的是便于操作及尽量减少其对子宫的损伤。在弯针时,当细段靠近小酒精灯的火焰时,要保证 4 ) 注射针、. 扶持针、移胚管葫芦部的制作 在制作好的注射针、扶持针、移卵管肩部,可增加一细段,增加的细段可使气流量减少,针尖动作幅度降低 ,从 酿 紐 腾 动 作 的 精 度 。 E S 细 胞 的 显 微 注 射 1 ) 实验小鼠的准备与要求 (1) 胚胎供体母鼠:一般以 6——8 周龄作为超排卵供体, 4〜 6 周龄母鼠产卵更多但卵细胞膜脆性较大,在处理过程中易破裂。而 6 周以后母鼠产卵逐渐减少。故用超排效果会更好。一般超排较好的母鼠每只每次可以得到 20〜 3 0 个囊胚。 2 ) 操作液 (I) E S 细胞培养液: E S M ; 3 ) 显微注射 (1) 显微注射系统注油:用矿物油注满显微注射系统。 胚 胎 移 植 1 ) 操作液胚胎操作液: M 2 液 ;麻醉剂: 846 合剂。 2 ) 胚胎移植 (1) 注射后的囊胚经 l〜 3 h 的恢复培养后于注射的当日或次日进行移植。 结 果 判 断 嵌合鼠的判定及嵌合鼠的交配:移胚后受孕的代孕母鼠在妊娠第 2 0 天左右自然分 注 意 事 项 (1) 在实验时间的安排上,尽可能安排在春夏,即动物运动活跃、繁殖性能和生产较旺盛的季节。
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实验步骤 | 状态指示灯。具 体操作如下: i. 平台温度控制器:改变平台的温度,并且可以显示平台的摄氏温度或华氏温度 。、平台温度预设为 3 7 ℃ ,按 下 「set」按钮可以看到平台的实时温度,持续按 住 「set」按钮的同时按上下按钮可以改变平台温度,注意:如果改变的幅度过大,平台可能最多需要 45 min 的加热时间。 ii停止按钮:可以立刻停止成像暗箱内部所有 4 个马达的运转。 注意:只有当发生严重故障时停止按钮才可以被按下,如当平台上升过程中,承载的样品过高可能会损坏成像暗箱时。按下停止按钮后,如需重新启动系统,请按照程序启动系统并进行初始化。切 断 I V I S 系统的电源,等 待 5s ,重新接通电源,点击镜头控制面板上的初始化按钮,完成初始化程序后就可以进行成像操作了。 iii光照强度控制旋钮:使用此旋钮可以改变成像暗箱内部 L E D 的光照强度,这 个 L E D 是用来照亮样品用的。 l e d 的 开 关 是 成 像 软 件 的 镜 头 控 面 板 「Light O n 」按钮。通过旋转按钮调整需要的光照强度,旋钮分十阶并有铃声提示,当达到所需的光照级别后,取消勾选镜头控制面板的「Light 〇 n」可以关掉 L E D 。 iv状态指示灯:指示是否可以打开成像暗箱门,只有当绿灯亮时才可以打开。一定不要在红灯亮时打开暗箱门。 (7) 气体麻醉:IVIS 系统包含一个麻醉气体控制装置,在成像暗箱的后面有 2 个 0.25英寸的进气口和出气口,暗箱的右边是控制开关,暗箱内也有 2 个 0.25 英寸的出气口和进气口分别位于样品台的左后和右后方。 注意:请仔细确认暗箱内的管道或其他固定装置不会发出荧光,使用者在进行成像操作前请测试这些管道和装置。 (8) 暗箱门的操作: IVIS 成像暗箱只需使用很轻的力即可牢固锁住箱门。请定期检查箱门的锁紧系统是否工作正常。连 接 IVIS 成像系统成像暗箱平台的挡帘可以遮盖住平台下部的空间,这个挡帘提醒使用者不要在平台下放任何物品。 (9) 成像前基本准备: a.黑色垫纸:尽管平台是经过黑色电镀处理的,但还是建议使用者在成像时在平台上垫一张高品质的黑色垫纸,特别当测试的是生物样本时。高品质黑色垫纸可以有效的阻止光反射,并且可以保持平台清洁。 b.将成像物品置中:将样品放置在成像平台正中,关上暗箱门,勾选镜头控制面板 上 的 「Live」按钮,监视器上将显示样品的图像。如果样品已经置中,取消勾选 「Live」按钮后就可以进行成像操作了,如果偏禽中心,点 击 「Live」按钮后,打开箱门,调整样品的位置,重复上述步骤直到在监视器上看到样品图像。 c.发光材料:使用者请牢记「任何物体都会发突光」,大部分塑料,几乎所有的磁带、植物、染料、吃的食物 (大部分是植物)、鼠尿、动物窝里的草垫都已经被证实可以发荧光,采用荧光成像时应尽量避免这些物质的污染。使用者操作IVIS 成像系统时应戴上手套。 (10) 系统关闭程序:不 建 议 在 1 天内多次开关系统,每天凌晨,通常是早上 4〜 6 点 ,IVIS 系统会自动进行背景测量和系统自检。如果必须关闭系统 , 一 定要严格按照以下步骤进行。 - a.保存实验结果,关闭活体成像软件。 b.关闭 IVIS 成像暗箱。 c.关 闭 Windows 操作系统。 |
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