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流式细胞术实验

标签: 流式细胞术 荧光 抗体制备与使用实验指南 第十三章

流式细胞术可用于:(1)细胞群体异质性检测;(2)单细胞水平上的多指标分析;(3)细胞分选。

实验方法
  • 流式细胞术实验
  • 直接标记法
  • 间接标记法
  • 胞内标记法
实验方法原理 流式细胞术(flow cytometry,FCM)是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段。它可以高速分析上万个细胞,并能同时从一个细胞中测得多个参数,具有速度快、精度高、准确性好等优点,成为当代最先进的细胞定量分析技术。FCM所有这些功能的实现依赖于一种特殊的仪器——流式细胞仪,它是综合了激光、电脑、流体力学、光学和荧光细胞学等先进技术的高科技产品。流式细胞主要是测量单个细胞经适当染色后所发出的散射光和荧光,经染色的细胞在悬液中以单行流过高强度光源的焦点,当每个细胞经过焦点时,发出一束散射光/荧光。它们经过过滤及光镜系统收集到一个光电检测器(光电倍增管或一个固态装置),光检测器把散射光定量转化成电信号,经数字转换器进行数字化后进行电子存储,以后数据可以调出显示和进行分析。流式细胞术不仅可测量细胞的大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,在细胞生物学、血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤

一、单细胞悬液制备方法


流式细胞术的分析检测建立在单个细胞的基础上,制备合格的单个分散的细胞悬液是非常关键的一环。对不同来源和不同形式的样品,根据各种样品的特点可选择不同的分散方法。


1. 单层培养细胞、血液、各种脱落细胞等样品,标本经过简单的制备悬液,离心分离处理,就可以得到分散较好的单个细胞悬液,是理想的流式细胞术检测对象。


2. 对于不同组织来源的实体组织标本,采用酶消化法、机械法和化学试剂处理法来分散细胞。


3. 石蜡包埋组织单细胞悬液的制备,可使大量存档的临床资料重新得到研究与利用,从而扩大了流式细胞术的应用范围。样品制备一般通过切片、脱脂、水化、消化及终止消化后过滤再收集细胞悬液,去除碎片的单细胞悬液用70%乙醇固定保存。


二、检测细胞周期各时相的细胞百分数


1. 培养或分离的细胞约为1×106,离心沉淀后用0.3ml含10%小牛血清的PBS悬浮,移入1.5ml EP管中,加入0.7ml无水乙醇,置-20℃下固定24h以上。


2. 3000 r/min离心30s,弃上清液,用lml PBS重悬细胞,再离心洗涤细胞一次。


3. 弃上清液,沉淀细胞用100μl 1mg/ml RNase A悬浮,37℃下放置30min。


4. 加入400μl 50μg/ml PI,置暗处10min。


5. 最后用流式细胞仪测定。


根据流式报告中给出G0/G1、S、G2/M各期细胞的百分比、凋亡百分比和细胞倍体进行实验分析。


三、流式细胞仪检测细胞凋亡(Heochst 33342/PI双染色法)


1. 悬浮生长的细胞在培养的状态下加入Heochst 33342,终浓度为l μg/ml;37℃培养箱孵育7——10min。


2. 500——1000 r/min低温离心5min,弃去染液。


3. 加入1.0ml PI染液,4℃避光染色15min。


4. 400目的筛网过滤1次。


5. 流式细胞仪检测分析。


四、结果观察


1. 根据流式报告中给出的G0/G1、S、G2/M各期细胞的百分比、凋亡细胞百分比和细胞倍体进行实验分析。


2. 细胞凋亡观察


Heochst 33342用氪激光激发的紫外线荧光,激发光波波长为352nm,发射光波波长为400——500nm,产生蓝色荧光;PI用氩离子激光激发荧光,激发光波长为488nm,发射光波长大于630nm,产生红色荧光。分析蓝色荧光对红色荧光的散点图或地形图。


3. 结果判断


在蓝色荧光对红色荧光的散点图上,正常细胞为低蓝光/低红光,凋亡细胞为高蓝光/低红光,坏死细胞为低蓝光。

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注意事项
1. 待测样本量至少lml,样本应在采集后6h内处理,不可使用冷冻的标本或溶血样本。


2. 细胞活性要好,否则易发生非特异性荧光染色。


3. 确保标本上机检测前的细胞浓度为1×106/ml,细胞浓度过低则直接影响检测结果。


4. 操作方面,保证流式细胞仪在整个工作过程中处于最佳状态,能保证定量检测的准确性和检测精度。使用标准样品调整仪器的变异系数在最小范围,分辨率在最好状态,能避免在测量过程中仪器条件的变化引起的检测误差。

5. 在红色荧光对蓝色荧光散点图上,还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹,可能是凋亡细胞的DNA进一步降解的缘故。


6. 用Heochst 33342染料与细胞孵育的时间不宜过长,一般控制在20min之内为宜。如果太长可引起Heochst 33342的发射光谱由蓝光向红光的迁移,导致红色荧光与蓝色荧光的比例改变,从而影响结果的判断。

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其他


5. 在红色荧光对蓝色荧光散点图上,还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹,可能是凋亡细胞的DNA进一步降解的缘故。


6. 用Heochst 33342染料与细胞孵育的时间不宜过长,一般控制在20min之内为宜。如果太长可引起Heochst 33342的发射光谱由蓝光向红光的迁移,导致红色荧光与蓝色荧光的比例改变,从而影响结果的判断。

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实验步骤

直接标记法

当使用多种荧光抗体标记细胞时,直接标记的荧光抗体可以同时加入,而不必按顺序加人。下面的实验实例显示的是用三种荧光抗体同时标记 T 淋巴细胞亚群,这些淋巴细胞是从红细胞和白细胞混合物中分离得到的。每种抗体都应提前进行使用浓度滴定。

实验材料

白细胞悬液(确定的细胞数量并经梯度纯化过)

anti-CD3 藻红蛋白(PE)

anti-CD8 荧光素(FITC)

anti-CD4 CyChrome(Cy5)

与特异性抗体蛋白浓度一致的 P E 、F IT C 、Cy5 标记的同型对照

PBS,p H 7.2,  4平衡

洗涤缓冲液(PBS+0. 1 % 叠 氮 钠 + 1 % 胎 牛 血 清 或 BSA) ,0. 22μm 滤 膜 过 滤 ,4℃平衡

甲酵 [Polysciences,Warrington,PA ;cat.No.18814, 不含甲醇,16(质量分数)]

时间
60〜90 min。

特殊仪器

离心机

细胞计数装置

微量移液器( 移液体积精确到 10〜200W 和 1000mI)

流式细胞仪

步骤

(1) 收获或分离细胞,用冰冷的清洗缓冲液制备单细胞悬液,调整细胞浓度至 5X105细胞/ml。

(2) 在 每 个 12 mmX 75 mm 管 加 人 Im l 细胞悬液以用于以下染色:每种抗体(一抗和同型对照)的单染;三种抗体的同时染色;一管不加抗体的阴性对照。

(3) 1500 g离心 3 min。用吸管吸弃上清液。注意不要吹散细胞沉淀。可以残留少量液 体 (约 100ul)。

(4) 按预先滴定量在每管中加人荧光标记的抗体或对照血清或同型对照。

(5) 振汤混勾,冰上避光放置 15 min。

(6) 加 人 Im l 冰冷 的 PBS。振荡混匀。

(7) 1500g离心 3 min。用吸管吸弃上清液。注意不要吹散细胞沉淀。

(8) 加 入 0.5 ml PBS 并振荡混匀。

(9) 加 人 0.5m l 甲醛固定液(2% ,体积分数)。避光保存于 4℃ 直到实验分析结束。

(10) 流式细胞仪每个样本检测 10000个门内细胞。

结果

图 13. 6 中流式细胞数据以双参数直方图的形式表示,1 轴和 3;轴分别表示两个不同的激发光,2;轴表示细胞数量,用量化的点密度来描述。每个样本通 S f i t c 对 照 PE、 PE对 照 CyChrome 和 FITC 对 照 CyChrome 来分析。单色标记的样本用来确定荧光存在于预期细胞群,并能调整存在于其他色轴此颜色信号的电子补偿。同型对照或未标记样本
直方图中的资料能用来获得阴性和阳性分析门,这 样 99% 的 阴 性 细 胞 落 在 阴 性 门 中 ,<1% 的细胞落在阳性门中。注 意 与 x 轴 和 3;轴交叉的两条线,它们划分出了落在每个象限的细胞数量。最下面的三幅图显示了只表达三种抗原表位中的一种的细胞(左上象限或右下象限)和表达其中两种抗原表位的细胞(右上象限)

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实验步骤

间接标记法

下面的实验实例显示的是用两种得到荧光抗体间接标记 T 淋巴细胞亚群,这些淋巴细胞是从红细胞和白细胞混合物中分离得到的。每种抗体都应提前进行滴定 。 一 抗都是鼠单克隆抗体,每种抗体同种型不同,从而能够选择标记有不同荧光染料的大鼠抗小鼠同种型的二抗进行标记。此方法可使用未标记的同种型抗体作为阴性对照。间接标记法可用于特定动物多克隆抗血清的染色。例如,羊源的特异性一抗可以用荧光染料 1 标记的抗羊的二抗进行染色,而兔源的特异性一抗可以用荧光染料 2 标记的抗兔二抗进行染色。
可以想象,用这种方法多色标记细胞时,每加入额外的或不同种属特异性一抗时,实验都会变得更复杂。另外还要考虑抗某种属特异性的多克隆抗体要通过其他物种抗体的吸附 ,以排除因抗体交叉反应而非特异地标记其他动物来源抗体的机会。

实验材料

此部分列出的抗体都能从 Southern Biotech(Birmingham,AL) 公司获得。每种抗体都有推荐的工作液浓度。标记的二抗使用浓度一般为 1ug/106 细胞。淋巴细胞悬液(细胞计数,经梯度离心纯化)

anti-CD3 I g G l 鼠单克隆抗体

anti-CD8 IgG2a 鼠单克隆抗体

鼠 Ig G l 和 IgG2a 同型抗体

P E 标记的兔抗鼠 Ig G l 亲和纯化抗体
FITC 标记的兔抗鼠 IgG2a 亲和纯化抗体

PBS,pH7.2,4℃ 平衡

漂洗缓冲液(PBS + 0. 叠 氮 钠 + 1 % 胎 牛 血 清 或 BSA) ,0.22um 滤 膜 过 滤 ,4℃平衡

甲醛 [Polysciences,Warrington,P A ;cat.No.18814, 不含甲醇,16 % (质量分数)

时间

90 〜 120 mino

特殊设备

离心机

细胞计数设备

微量移液器 (移液体积精确到 10 〜200ul和 1000uI)

流式细胞仪

步骤

(1) 收获或分离细胞,用冰冷的清洗缓冲液制备单细胞悬液,调整细胞浓度至 5 X 105细胞/ml。

(2) 在为每种抗体(未标记的一抗和同型对照)准 备 的 12m m X75m m 管 中 加 人 Iml细胞悬液,另备两只管,分别装所有抗体和只加二抗对照。

(3) 1500 g 离 心 3m in。用吸管吸弃上清液。注意不要吹散细胞沉淀可以残留少量液体(约 100ul)。

(4) 加人预先滴定过的适量抗体 (一抗或同型对照)。

(5) 混句,冰上避光放置 15min。

(6) 加 人 I m l 冰冷的清洗缓冲液。震荡混匀。

(7)1500 g 离心 3m in。用吸管吸弃上清液。注意不要吹散细胞沉淀。可以残留少量液体(约 IOOuI)。

(8) 按厂家推荐的使用浓度在每管加入二抗。

(9) 振荡混勾,冰上避光放置 15m in。

(10) 加 入 Im l PBS。振荡混匀。

(11) 1500 g 离 心 3m in。用吸管吸弃上清液。注意不要吹散细胞沉淀。

(12) 加 人 0.5 ml PBS 并振荡混勻。

(13) 加 人 0.5m l 甲醛固定液(2 % ,体积分数)。实验分析结束前将样本避光保存于 4℃

(14) 用流式细胞仪分析每个样本,检测 1 0000个门内细胞。

结果

预期结果应与图 13. 6 中 H T C 与 P E 组合图形相似,其更大的优点在于信噪比较好,阴性细胞落于更左下的象限,阳性细胞位于其他三个象限。这是由于多个荧光标记的二抗能与结合同一未标记的一抗,从而具有潜在的信号放大效应。实验结果分析与前相同

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实验步骤

胞内标记法

胞内蛋白的检测可以包括细胞分泌产物(如细胞因子)、组成结构(如微管蛋白)或细胞内整合产物 (B rd U 或病毒蛋白等)。就分泌产物而言,可以是某些形式的细胞激活研光 。在这类实验中,可 以 使 用 蛋 白 质 分 泌 阻 断 剂(如 m onensin 或 brefeldin A ,均可从Sigma A ld ric h 获得)使蛋白质不能分泌而在高尔基体中聚积,这有助于在设立实验时对抗体使用浓度的滴定以及证明抗体是否与正确的抗原结合。 monensin 处理过的细胞应未处理过的细胞荧光强度高 [6]。此 外 ,为了保证荧光标记的染色是胞内蛋白(而不是膜上蛋白),在细胞被固定前可用未标记荧光的抗体与之预先孵育以封闭细胞表面抗原。

对胞内染色的细胞首先要对细胞进行固定,并使细胞膜通透性增加。对固定的细胞增加膜通透性才能使标记抗体进入细胞与胞内蛋白结合。常用的固定剂是 P B S 溶解的多聚甲醛(paraformaldehyd) 溶 液 ,它能使蛋白质发生交联,但是这种固定方法可能会限制抗体识别抗原。固定剂的浓度范围为 0 . 2 5 % 〜4 % ( w /V )。其他组织固定剂(如甲醇等)可能会使抗原结构改变从而影响抗体的染色,因为有些抗体识别的是抗原的构象表位 。就增加细胞膜通透性的方法,含 0.1% 皂素(saponin) 的平衡盐溶液就足以使抗体进入细胞 。 也可使用其他细胞膜渗透剂(如 0 . 0 2 % 的 T w e e n 2 0 ) 。 由于这种细胞膜通透作用可以消失,有必要在所有溶液中加人皂素 (包括染色和洗涤过程)。

使用荧光直接标记的单克隆抗体(与多克隆抗体的间接标记相比)能使抗体的非特异性结合的可能性减至最小,这也使研究者有可能使用同型对照从而进一步验证抗体结合的特异性。为了使样本保存的时间比隔夜保存更长,在细胞内染色完成后可将样本重悬于甲醛溶液中。

实验材料

甲醛 [Polysciences,Warrington,P A ;cat.No.1 8 8 1 4 , 不 含 甲 醇 ,1 6 ( w /v ] ,用 PBS1 : 4 稀释,终浓度为 4 % ( w/V)

PBS (PH 7. 2)

皂素缓冲液,0 . 1%(W V ) 皂素溶于含 0 . 0 5 % ( w /V ) N a N 3 的 H an k s'平衡盐溶液。室温 保 存 1 个月稳定

Alexa 4 8 8 标记的抗胞内抗原的单克隆抗体

标记的同型对照抗体

时间

90 〜 120 mm。

特殊设备

离心机

细胞计数设备

微量移液器(移液体积精确到 10〜200ul 和 1000ul)

流式细胞仪

实验步骤

在一些实验方案中,研究者可能希望同时标记胞内和胞外抗原。在这种情况下,首先标记胞外抗原,然后进行如下实验步骤(固定、增加膜通 透 性 、胞内标记)。

(1) 1500 g 离心 3m in 收 获 5 X105个细胞,吸管吸弃上清。加 人 imlPBS,振荡混匀重悬细胞,获得单细胞悬液。

(2) 加 入 Im l 冰上预冷的 4 % 甲醛固定液,室 温 孵 育 10 min (每隔几分钟振荡混匀细胞 ,确保细胞为单细胞悬液)。

(3) 1500 g·离心 3 min。吸管吸弃上清。注意不要吹散细胞沉淀。 imi PBS 重悬细胞沉淀。

(4) 1500 g·离心 3 min。吸管吸弃上清。注意不要吹散细胞沉淀块。 Im l 皂素缓冲液重悬细胞沉淀。

(5) 1500 g 离 心 3 min。吸管吸弃上清。注意不要吹散细胞沉淀。

(6) 100^1 皂素缓冲液重悬细胞沉淀。

(7) 加人适量抗体(一抗或同种型)

(8) 轻轻混匀试管,室温避光孵育 30 min。

(9) 重复步骤 (4) 和 (5)。

(10) 加 入 Iml PBS,轻轻混匀,1500 g 离 心 3 min。

(11) 加 入 0.5 ml PBS,轻轻混匀。

(12) 流式细胞仪每个样本获得 1 0000个门内细胞。

结果

图 13. 7 显示的是一个胞内染色流式细胞仪分析数据实例,其 中 x 轴 表 示 Alexa 488焚光强度,^ 轴表示细胞数量,A 图为阴性对照,B 图为阳性标记的胞内抗原。直方图中显示的是用软件分析的一群相同细胞中阳性(信)细胞和阴性(噪)细胞的荧光强度均值。在标准化的流式细胞仪上(如本章中序言,仪器显示和质量控制中所述),仪器操作者应每天用已知 MESF 值的多个荧光强度的微珠校准仪器。这种情况下,微珠数应该与荧光染
料分子数量一致。这样直方图所绘出的 MESF 的相对值与仪器显示的荧光强度一致,呈线性关系。如果研究者想要定量测量荧光 MESF 值 ,首先要告诉操作者,在样本上机前,应将仪器设定在分析多种微珠荧光强度的设置,从而能得到样本的不同荧光强度。这类实验可能对研究者希望比较抗原表达水平有用(细胞内的和细胞外的),如不同时间的、动物与动物之间的治疗前后的抗原表达

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