标签: 免疫组织化学 特异性抗体 组织切片 抗原 抗体制备与使用实验指南 第十一章
免疫组织化学(immunohistochemistry,IHCS)是用特异性抗体检测组织切片中抗原的一种方法。在鉴定蛋白质方面,IHC有着其他技术无法比拟的独特优点,可以将抗原检测与其在组织或细胞中的定位联系起来,这对于正常或病理组织的细胞功能研究具有重要意义。19世纪40年代末[1],Coons首先建立了免疫组织化学法,随后被广泛应用到生物学的多个领域,包括细胞功能研究、肿瘤形成过程的研究,以及感染性疾病的检测等。免疫组织化学,顾名思义,是将3个重要领域连接起来:形态学、组织化学和免疫学。本章将会重点介绍组织切片中抗原的检测,也会简单介绍细胞玻片的染色(这种情况应称为免疫细胞化学) 作者:霍华德,本实验来自「抗体制备与使用实验指南」
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实验步骤 |
载 玻 片高质量的免疫组化结果需要组织切片与载玻片之间很好地结合,以防止由于组织黏附问题导致的试剂聚集和假染色。商品化的专门用来进行免疫组织化学染色的载玻片是经过标准化包被的。这里将介绍两种方法对常规载玻片包被以用于免疫组织化学染色。 一、聚左旋赖氨酸(poly-L-Iysine) 包被玻片法(1) 准 备 0. l % ( w/V) 聚左旋赖氨酸水溶液(Sigma P-8920)。 (2) 将载玻片浸人溶液中。 (3) 室温干燥。 (4) 室温保存。 二、 APTS 包被破片法(1) 准备含 2 % ( V/V) 硅烷(Sigma A-3648) 的丙酮溶液。 (2) 将载玻片浸人丙酮中 1〜5 min。 (3) 将载玻片浸人含 2 % 桂焼的丙酮溶液中 1〜5 min。 (4) 将载玻片在丙酮溶液中连续洗两次,每 次 5 min。 (5) 室温干燥并储存。 三、 细 胞 涂 片 / 离 心 细 胞 涂 片 制 备(1) 在硅烷/聚左旋赖氨酸包被的载玻片制备细胞刮片/细胞离心涂片。 (2) 室温下干燥 30 min。 (3) 在预冷的、新鲜的丙酮中一 20°C 固 定 20 min。 (4) 室温下风干至少 15 min。 (5) 对细胞刮片/细胞离心涂片染色。 五、 注意(1) 1 0 0 % 乙醇可替代新鲜丙酮使用;固定剂的选择取决于组织中要染色的目的抗原。 (2) 未染色的载玻片可以包被在铝箔中 ,-20°C 保存。当准备染色时:打开铝箔,取出载玻片并恢复至室温,用保存之前相同的固定剂进行后固定至少 30s ,风 干 切 片 ,在缓冲液中再水化 5 min,然后进行染色。 (3) 未染色载玻片的稳定性取决于抗原性质;一些抗原很不稳定必须涂片后立刻染色。 六、 冰 冻 切 片(1) 切 4 个 7pm 厚的未固定的冰冻切片。 (2) 将切片置于硅烷/聚左旋赖氨酸包被的载玻片上。 (3) 将切片在空气中风干 30 min。 (4) 置于预冷至 4°C 的新鲜丙酮中,固 定 20 min。 (5) 室温风干切片至少 15 mm。 七、 注意(1) 1 0 0 % 乙 醇 可 替 代 新鲜丙酮使用;固定剂的选择取决于组织中要染色的目的抗原。
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去 污 剂 和 离 液 序 列 高 的 物 质 去污剂可在水溶液中形成微粒,能降低水表面张力,所以也是一种表面活性剂。去污剂模拟脂质双分子层环境,可以溶解膜蛋白,形成由脂质、去污剂及含蛋白质的去污剂微团组成的混合微粒 (通常一个微粒包含一个蛋白质分子)。免疫组化方法中较为常用的去污剂是非离子型,这些物质适合于打断脂质-脂质、脂质-蛋白质间的相互作用而不破坏蛋白质-蛋白质相互作用;因此不是变性剂。非离子化去污剂主要包括 TritonR-X 100 、 Tween 折散剂包括盐酸胍、硫氰酸钠、铯 等 ,被认为是蛋白质变性剂,通过打开蛋白质复合体而部分打开或逆转福尔马林导致的蛋白质交联。通常使用去污剂或拆散剂的抗原修复法比 酶 抗 原 修 复 法 和 热 抗 原 修 复 法(H IE R ) 效 率 低 ,一 般 与 酶 或 加 热 联 合 使 用 。 一、酶抗原修复法在 热 诱 导 抗 原 修 复 法 出 现 之 前 ,蛋 白 酶 诱 导 的 表 位 修 复( Protease-induced epitope retriev a l,P IE R ) 是 最 为 常 用 的 方 法 。许 多 酶 都 曾 被 应 用 于 这 一 技 术 中 ,其 中 最 常 用 的 是 胰蛋 白 酶( tryp sin ) 、蛋 白 酶 K 、链 霉 蛋 白 酶(prom ise) 、无 花 果 蛋 白 酶(ficin ) 及 胃 蛋 白 酶(pepsin) ™ 。蛋 白 酶 诱 导 的 表 位 修 复 作 用 机 制 很 可 能 是 通 过 酶 消 化 打 断 福 尔 马 林 固 定 过程 产 生 的 蛋 白 质 交 联 ,但 这 种 断 裂 是 非 特 异 性 的 ,对 某 些 抗 原 具 有 负 性 影 响 。蛋 白 酶 诱 导的 表 位 修 复 效 果 取 决 于 酶 的 浓 度 和 种 类 、孵 育 参 数( 时 间 、温 度 、p H ) 以 及 样 本 被 固 定 的 时间 。酶 消 化 时 间 与 样 本 被 固 定 的 时 间 呈 负 相 关 。 我 们 以 及 其 他 一 些 实 验 室 通 常 对 少 数 酶的 诱 导 表 位 修 复 条 件 进 行 优 化 而 不 是 对 很 多 种 酶 进 行 尝 试 。我 们 使 用 的 是 一 种 市 售 的 立即 可 用 的 蛋 白 酶 K 溶 液 ,在 室 温 下 具 有 很 好 的 活 性 ,可 用 于 自 动 化 免 疫 染 色 装 置 。 蛋 白酶 诱 导 的 表 位 修 复 方 法 的 缺 点 :不 是 大 多 数 抗 原 的 最 适 修 复 方 法 ; 可 能 导 致 组 织 形 态 学 的改 变 ;可 能 破 坏 抗 原 表 位 。 以 下 将 介 绍 三 种 酶 消 化 法 。 三、 胰蛋白酶(参见试剂准备)(1) 将 玻 片 浸 入 〇. 1 % 胰 蛋 白 酶 溶 液 (p H 7. 8 ) ,37°C 孵 育 1 0 〜 30m in 。 (2) 用 自 来 水 彻 底 漂 洗 。 (3) 随 后 的 步 骤 为 免 疫 组 织 化 学 染 色 方 法 。 不 同 公 司 、不 同 批 次 生 产 的 胰 蛋 白 酶 溶 液 活 性 不 同 ,会 影 响 抗 原 修 复 的 结 果 。 四、 蛋白酶(1) 在 组 织 切 片 上 滴 加 0. 0 5 % 〜 0. 5 % ( w /V ) 温 热 的 蛋 白 酶 X X I V , 37°C 孵育 10 〜 25m in 。 (2) 用 自 来 水 彻 底 漂 洗 。 (3) 随 后 的 步 骤 为 免 疫 组 织 化 学 染 色 方 法 。 五、胃蛋白酶(1) 将 玻 片 浸 人 〇. 4 % ( ™ / V ) 胃 蛋 白 酶 溶 液 。 (2) 37°C 孵 育 10〜 25m in 。 (3) 用 自 来 水 彻 底 漂 洗 。 (4) 随 后 的 步 骤 为 免 疫 组 织 化 学 染 色 方 法 。 六、 热 诱 导 抗 原 决 定 簇 修 复(H IER) 接 下 来 要 介 绍 的 这 一 组 抗 原 修 复 方 法 彻 底 改 变 了 在 交 联 固 定 剂 中(如 甲 醛 )固 定 的 抗原 的 免 疫 组 织 化 学 检 测 。 热 诱 导 抗 原 决 定 簇 修 复 是 基 于 Fraenklen-C o n r a t 和 他 们 的 合作 者 提 出 的 一 个 概 念 [9],他 们 证 实 蛋 白 质 和 福 尔 马 林 之 间 的 化 学 反 应 通 过 高 温 加 热 或 强的 加 碱 水 解 至 少 可 部 分 逆 转 [3]。 目 前 其 机 制 尚 不 清 楚 ,但 它 的 最 终 效 应 是 恢 复 抗 原 在 固 固定的程度可显著影响抗原对抗原修复的反应。未 固 定 的 蛋 白 质 在 70〜90°C 的温度条件下可发生变性,但经甲醛固定后在该温度下将不会变性。因此使用不同抗原修复 七、 微波炉热诱导抗原决定簇修复(1) 选择带转盘的微波炉,计时器,设置功率,取两个塑料量杯,分 别 放 入 5 〇〇 ml 缓冲液(浸泡玻片用)和 200m l 水 ,750W 加 热 2m in ,取出量杯。 (2) 将脱蜡玻片完全浸入热的缓冲液中,轻轻盖上杯盖。 (3) 750W 加 热 5m in(需要将溶液烧沸)。 (4) 观察缓冲液的液面,并且添加热水将溶液量恢复到初始水平。 (5) 在整个所需要的时间内 (15〜20 min) 重复步骤 (3)、(4)。 (6) 将容器从微波炉中取出,放入冷自来水中 15min 。 (7) 用蒸馏水清洗玻片,继续免疫染色的步骤. 八、注意如果选择这种方法进行抗原修复,需要注意一点:由于微波炉内温度变化,可能导致染色结果不一致。 高压锅法热诱导抗原决定簇修复 九、试剂和仪器Decloaker(Biocare M edical,DC2002) 组织切片容器 (T e k 公司) 或塑料玻片染色缸(Coplin 公司) H IE R 缓冲液 蒸馏水 方法(1) 电热锅接上电源,放人托盘。 (2) 向咼压锅内放入 500m l 去离子水,打开拨动开关。 (3) 将 需 热 修 复 的 玻 片 放 人 盛 有 250m l 修 复 缓 冲 液 的 T issu e T e k 容 器 中 ,也 可 选 择盛 有 50m l 修 复 缓 冲 液 的 塑 料 C o p lin 染 缸 。 (4) 将盛有玻片的容器放人高压锅的中央。 (5) 将热防护层放入高压锅的中央。 (6) 将监 护 器 Steam S trip 放在染色皿上,盖上盖子并拧紧。 (7) 盖上蒸汽喷嘴。 (8) 检查所显示的各个参数。 (10) 按 D is p la y 键 调 到 S P l ,并按开始键。 (11) 当计时器响起时,按开始/停止键。 (12) 当温度达到 90 °C 时 ,计时器会再一次响起。 (13) 按开始/停止键结束程序,压力读数为〇。 (14) 打开盖子,将玻片冷却几分钟。 (15) 移开玻片容器盖子,用自来水缓慢冲洗玻片。 (16) 将玻片浸入漂洗缓冲液。 注意 (1) 玻片脱赌并再水化后,要一直防止玻片完全干燥。 蒸汽发生器法热诱导抗原决定簇复原(1) 将蒸汽发生器底部灌满水。 (2) 将 盛 有 250m l 修复缓冲液的 T issu e T e k 容器放人蒸汽发生器的篮子中。也可选择盛有 50m l 修复缓冲液的塑料 CopUn 染缸。 (3) 打开蒸汽发生器,预 热 Tissue T e k 容 器 或 塑 料 C o p lin 染缸中的抗原修复缓冲液 。通过蒸汽发生器盖子上的小孔放人一支温度计至缓冲液中,将缓冲液加热到 95°C 。 (4) 当温度上升到 9 5 °C 时 ,迅速将组织切片放入缓冲液中(避免手碰到溶液),将缓冲液温度重新加热到 95°C 。 (5) 当温度上升到 9 5 °C 后继续蒸汽 20m in , 或者根据修复抗原的不同选择蒸不同的时间。 (6) 将盛有玻片的量杯移出,室温冷却 20m in。 (7) 流水冲洗 lO m in 。 (8) 将玻片放入漂洗缓冲液中,后续步骤同免疫组化染色的步骤
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免疫酶技术免 疫 组 化 技 术 种 类 繁 多 ,通 常 对 经 典 方 法 的 改 进 可 优 化 免 疫 反 应 ,提 高 对 抗 原 的 检测 。任何一种免疫组化方法的最终目标是:在尽可能少的背景下,检测到最大量的抗原(最大值的信噪比)。过去,只能采取一些直接法 (用酶或荧光染料标记一抗),虽然可快速地检测到抗原,但敏感性低。间接法是指不标记一抗的一些方法,这些方法由两层或两层以上的试剂组成,通常最后一层含有标记,操作起来比较繁琐,但敏感性较高(是直接法的几百倍),是 目 前 IH C 中较常用的方法。通常有这样一个规律 (但也有例外),实验技术越复杂其灵敏度也越高。这部分将重点介绍福尔马林固定、石蜡包埋切片的免疫酶技术,而对于在其他固定剂固定的组织、冷冻切片、细胞离心涂片等,该技术也相似。选择什么方法要根据要检测抗原的量、所需敏感度水平、实验室技术能力等。 目前有许多检测试剂盒 ;下面介绍的技术中我们将使用一些适用于自动染色仪器的市售试剂盒。可在自动染色仪器中操作的步骤取决于仪器型号种类。 直接法方法 (1) 切片用二甲苯或其替代物脱蜡两次。 (2) 1 0 0 % 乙醇(两次,每 次 5 min) , 9 5 % 乙醇(两 次 ,每 次 5 min) 水化切片。用水清洗切片充分洗掉乙醇。 (3) 如果需要加热抗原修复或 37°C 酶抗原修复,可在这一步进行。 (4) 将切片在缓冲液中放置 5 min,然后转移到自动染色仪器中。 (5) 阻断内源性过氧化物酶。 (6) 缓冲液中清洗切片。 (7) 室温下,蛋白 酶 K 法抗原修复(如果需要),5 min。 (8) 将切片在非特异封闭液中孵育 1 〇 〜2 〇 min 。 (9) 不要清洗,将液体吹干(如果徒手操作用滤纸吸干)。 (10) 将切片在标记的一抗中解育 30 min。 (11) 用漂洗缓冲液清洗三次。 (12) 将切片在 DAB 溶液中孵育 5〜lOmin。 (13) 用蒸馏水清洗切片。 (14) Mayer’s 苏木精复染。 (15) 蒸馏水清洗切片,用稀释的氢氧化铵溶液蓝染切片。 (16) 95% 乙醇 (两次,每 次 3〜5 min) ,100% 乙醇(两 次 ,每 次 3〜5 min) ,二甲苯或代替物(两次,每 次 3〜5 min) 脱水。 (17) 用合成封固剂封片。 结果 抗原/抗体反应部位: 棕色。 细胞核: 蓝色。 间接法间 接 免 疫 酶 法 下面是两步法的第一步。 方法 (2) 在 1 0 0 % 乙醇 (两次,每 次 2m in) , 9 5 % 乙醇 (两次,每 次 2m in) 水化切片。用水清洗切片,充分洗掉乙醇。 (3) 如果需要热诱导抗原修复或 37°C 酶法抗原修复,可在这一步进行。 (4) 将切片在缓冲液中放置 5m in ,然后转移到自动染色仪器中。 (5) 阻断内源性过氧化物酶。 (6) 缓冲液中清洗切片。 (7) 室温下,蛋白 酶 K 法抗原修复 (如果需要),5 min。 (8) 将切片在非特异封闭液中孵育 10〜20min。 (9) 不要清洗,将残留液体吹干(如果徒手操作可用滤纸吸干)。 (10) 将切片在未标记的一抗中娜育 30m in。 (11) 用漂洗缓冲液清洗三次。 (12) 在标记的二抗中孵育 30min。 (13) 用漂洗缓冲液清洗三次。 (14) 将切片在 D A B 溶液中孵育 5〜lO m in。 (15) 用蒸馏水清洗切片。 (16) Mayer’s 苏木精复染。 (17) 蒸馏水清洗切片,用稀释的氢氧化铵溶液蓝染切片。 (18) 依 次 用 9 5 % 乙醇(两 次 ,3〜5m in) ,1 0 0 % 乙醇(两次,3〜5m in) ,二甲苯或代替物(两次,3〜5m in) 脱水。 (19) 用合成封固剂封片。 结果 抗原/抗体反应部位: 榇色。 细胞核: 蓝色 (如果抗原为核蛋白,胞核的颜色则是棕色和蓝色的混合色)。 注意事项尽管通常在孵育一抗前对内源性过氧化物酶进行阻断,但有些抗原(尤 其 是 CD) 对这一操作十分敏感,若所使用的过氧化氢溶液浓度较高,将会更加敏感。这种情况下,此项操作可以在孵育一抗后,添加含过氧化物酶的试剂之前进行。 聚 合 物 免 疫 酶 法这种方法比间接法更灵敏。在一个高分子惰性骨架(如葡聚糖微球) 上结合许多分子标记 (如过氧化物酶)以及可识别一抗的免疫球蛋白分子(如山羊抗兔免疫球蛋白)(本例中连接的是兔免疫球蛋白)。由于反应中不涉及亲和素或生物素分子,因此该方法的另外一个优点是不存在内源性亲和素-生物素背景。高分子技术检测试剂盒通常要比亲和素-生物素方法昂贵。 方法 (1) 切片用二甲苯或替代物脱蜡两次。 (2) 用 1 0 0 % 乙醇 (两次,每 次 5m in) , 9 5 % 乙醇( 两次,每 次 5m in) 水化切片。 (3) 如果需要热诱导表位决定簇恢复或 37。 (3 酶法抗原修复,可在这一步进行。 (4) 将切片在缓冲液中放置 5min。 (5) 封闭内源性过氧化物酶。 (6) 缓冲液中清洗切片。 (7) 室温下,蛋 白 酶 K 法抗原修复(如果需要),5 min 。 (8) 将切片在非特异结合封闭液中孵育 10〜2 0 min 。 (9) 不要清洗,将残留液体吹干(如果徒手操作用滤纸吸干)。 (10) 将切片在未标记的一抗中孵育 30m in。 (11) 用漂洗缓冲液清洗三次。 (12) 在高分子-免疫球蛋白-酶复合体中孵育 30m in。 (13) 用漂洗缓冲液清洗三次。 (14) 将切片在 D A B 溶液中孵育 5〜lO m in。 (15) 用蒸馏水清洗切片。 (16) Maye^ s 苏木精复染(通常在自动染色器外操作)。 (17) 蒸馏水清洗切片,用稀释的氢氧化铵溶液蓝染切片。 (18) 依 次 9 5 % 乙醇(两次,3〜5m in)、1 〇〇 % 乙醇(两 次 ,3 〜5m in)、二甲苯或代替物(两次,3〜5m in) 将切片脱水。 (19) 用合成封固剂封片。 结果 抗原/抗体反应部位: 踪色。 细胞核:蓝色(如果抗原为细胞核,则胞核的颜色是棕色和蓝色的混合色)。 多步法多步法要比间接法繁琐但灵敏高。该方法以亲和素(avidin,卵白中发现的一种糖蛋白)或链亲和素(streptavidin,为 菌 中 的 一 ‘ 种 糖 蛋 白)与生物素(bio tin ,蛋黄中 的一种糖蛋白 )之间的高 亲和力 为基础 。亲和素含有 4 个亚基 ,组成 了三级结构中含有 4 个疏水性生物素的结合位点,但亲和素含有的低聚糖残基对组织成分具有一定的亲和力,导致非特异性结合。链亲和素缺乏低聚糖残基且其等电点为中性,因此产生的背景较低。通常生物素连接到二抗或酶上(每分子免疫球蛋白可连接多达 150 分子的生物素)。亲和素-生物素方法中的标记分子通常为亲和素分子(第三层试剂)。该方法是目前免疫组织化学中灵敏度高,且应用最为广泛的方法(图 11.3)。 链亲和素-生物素标记法(1) 切片用二甲苯或替代物脱蜡两次。 (2) 依 次 用 1 0 0 % 乙醇 (两次, 每次 5m in) ,9 5 % 乙醇 (两次,每 次 5m in) 水化切片。 (3) 如果需要热诱导抗原决定簇修复或 37°C 酶法抗原修复,可在这一步进行。 (4) 将切片在缓冲液中放置 5m in ,然后放到自动染色仪器中。 (5) 封闭内源性过氧化物酶。 (6) 用缓冲液清洗切片。 (7) 室温下,蛋白 酶 K 法抗原修复(如果需要),5m in。 (8) 将切片在非特异封闭液中孵育 10〜20m in 。 (9) 不要清洗,将残留液体吹干(如果徒手操作可用滤纸将液体吸干)。 (10) 将切片在未标记的一抗中孵育 30m in。 (11) 用漂洗缓冲液清洗三次。 (12) 在生物素化的二抗中孵育 30m in。 (13) 用漂洗缓冲液清洗三次。 (14) 在第三层试剂中孵育(过氧化物酶标记的亲和素/链亲和素)30min。 (16) 在 D A B 溶液中孵育 5〜lO m in。(17) 蒸馏水清洗切片。 (18) Mayer’s 苏木精复染 (通常在自动染色仪器外操作)。 (19) 蒸馏水清洗切片,用稀释的氢氧化铵溶液蓝染切片。 (20) 9 5 % 乙醇(两次,3〜5 min)、1 0 0 % 乙醇 (两次,3〜5m in) 、二甲苯或代替物(两次,3〜5 min) 脱水。 (21) 用合成封固剂封片。 结果 抗原/抗体反应部位: 棕色。 细胞核: 蓝色(如果抗原在核内,则胞核的颜色是掠色和蓝色的混合色)。 链亲和素生 物 素 复 合 体 法方法 (1) 切片用二甲苯或替代物脱蜡两次。 (2) 依 次 用 1 0 0 % 乙醇 (两次,每 次 5m in) , 9 5 % 乙醇 (两次,每 次 5m in) 水化切片。 (3) 如果需要热诱导抗原决定簇修复或 37°C 酶法抗原修复,可在这一步进行。 (4) 将切片在缓冲液中放置 5min。 (5) 阻断内源性过氧化物酶。 (6) 用缓冲液清洗切片。 (7) 室温下,蛋 白 酶 K 法抗原修复(如果需要),5m in。 (8) 将切片在非特异封闭液中孵育 10〜20m in。 (9) 不要清洗,将残留液体吹干(如果徒手操作可用滤纸将液体吸干)。 (10) 将切片在未标记的一抗中孵育 30m in。 (11) 用漂洗缓冲液清洗三次。 (12) 在生物素化的二抗中孵育 30m in。 (13) 用漂洗缓冲液清洗三次。 (14) 在第三层试剂(亲和素-链亲和素-过氧化物酶复合体)中孵育 30m in。 (15) 用漂洗缓冲液清洗三遍。 (16) 在 D A B 溶液中孵育 5〜lO m in。 (17) 蒸馏水清洗切片。 (18) Mayer、 苏木精复染(通^ 在自动染色器外操作)。 (19) 蒸馏水清洗切片,用稀释的氢氧化铵溶液蓝染切片。 (20) 依次 用 9 5 % 乙醇 (两次,3〜5m in)、1 0 0 % 乙醇(两 次 ,3〜5m in)、二甲苯或代替物(两次,3〜5 min) 脱水。 (21) 用合成封固剂封片。 结果 抗原/抗体反应部位: 棕色。 细胞核: 蓝色(如果抗原在核内,则胞核的颜色是棕色和蓝色的混合色)。 注意事项亲和素和过氧化物酶溶液在加到玻片上之前需在试管内预孵育以形成复合物。 酪胺法(亲和素-生物素或荧光素法)与传统 A B C 方法相比,酪胺法可将免疫反应放大 1 〇〇 〜1000 倍 ,一抗的稀释倍数也可提高几百倍。与亲和素或抗荧光素抗体结合的过氧化物酶与酪胺二次反应后,生物素或荧光素标记的酪胺分子发生沉淀是该方法的基本原理。最初,该方法是以亲和素-生物素结合为基础,但这种结合反应的高敏感性也增加了内源性亲和素-生物素产生背景的机会 。最近发展的一种荧光素的方法虽然可以避免这种问题的发生,但敏感性也降低了,而且仍然可能产生背景。 目前有文章报道了改进的可降低背景的酪胺法 [11]。 方法 (1) 切片用二甲苯或替代物脱蜡两次。 (2) 依 次 用 1 0 0 % 乙醇 (两次,每 次 5m in)、9 5 % 乙醇(两 次 ,每 次 5m in) 水化切 片 。 (3) 如果需要热诱导抗原修复或 37°C 酶法抗原修复,可在这一步操作。 (4) 将切片在缓冲液中放置 5m in。 (5) 封闭内源性过氧化物酶。 (6) 缓冲液中清洗切片。 (7) 室温下,蛋 白 酶 K 法抗原修复(如果需要),5m in。 (8) 将切片在非特异封闭液中孵育 10〜20m in。 (9) 不要清洗,将残留液体吹干 (如果徒手操作可用滤纸将水吸干)。 (10) 将切片在未标记的一抗中孵育 30m in。 (11) 用漂洗缓冲液清洗三次。 (12) 在生物素标记的 F (ab’)2 抗(亲和素-生物素法)或过氧化物酶标记的抗鼠 I gG(荧光素法)中孵 育 15m in。 (13) 用漂洗缓冲液清洗三遍。 (M ) 对于亲和素-生物素法,用过氧化物酶-链亲和素-生物素复合体孵育 15min; 而对于荧光素法,用荧光素标记的酪胺放大系统试剂孵育15min。 (15) 用漂洗缓冲液清洗三遍。 (16) 对于亲和素-生物素法,用生物素标记酪胺放大系统试剂孵育 15m in; 而对于荧光素法,用过氧化物酶标记抗荧光素抗体孵育 15min。 (17) 用漂洗缓冲液清洗三次。 (18) 对于亲和素-生物素法,用过氧化物酶-链亲和素复合体孵育 15m in; 而对于突光素 法 ,直接进行步骤 (20)。 (19) 用漂洗缓冲液清洗三次。 (20) 在 D A B 底物-色原中孵育 5min。 (21) 用蒸馏水清洗。 (22) Mayer’s 苏木精复染。 (23) 蒸馏水清洗切片,用稀释的氢氧化铵溶液蓝染切片。 (24) 依 次 用 9 5 % 乙醇(两次,每 次 3〜5m in)、1 0 0 % 乙醇(两 次 ,每 次 3〜5m in)、二甲苯或代替物 (两次,每 次 3〜5m in) 脱水。 (25) 用合成封固剂封片。 结果 抗原/抗体反应部位: 棕色。 细胞核: 蓝色(如果抗原为细胞核,则胞核的颜色是棕色和蓝色的混合色)。 免疫组化检测多抗原 一直以来,检测同一组织切片中的多个抗原较为困难。有些检测试剂盒通过标记两种不同的酶 (如 H R P 和 A P ) 来检测至少两种抗原。这种试剂盒灵敏度很高但价钱也十分昂贵。多抗原检测的关键问题在于抗原的部位 (相同的或不同的组织、细胞或细胞器)。必须精心选择每种抗原的色原以使抗原之间实现最好的区分。 Vector Laboratories 公司的目录包括很多双重免疫染色中酶底物组合使用的例子 (www .vectodabs.com)。如果 抗 来 源 于 不 同 动 物 的 双 免 疫 酶 染 色 法 [12]该方法为应用不同动物种类的一抗进行直接/间接染色。 方法 (1) 切片用二甲苯或替代物脱蜡两次。 (2) 依 次 用 100% 乙 醇(两 次 ,每 次 5 min) 、9 5 % 乙 醇(两 次 ,每 次 5 min) 水化切片。 (3) 如果需要热诱导抗原修复或 37°C 酶法抗原修复,可在这一步操作。 (4) 将切片在缓冲液中放置 5min。 (5) 封闭内源性过氧化物酶。 (6) 缓冲液中清洗切片。 (7) 室温下,蛋 白 酶 K 法抗原修复 (如果需要),5m in。 (8) 将切片在非特异结合封闭液中孵育 1 0 〜2 0 m in 。 (9) 不要清洗,将残留液体吹干(如果徒手操作可用滤纸吸干)。 (10) 将切片在两种未标记的一抗中解育 30m in。 (11) 用漂洗缓冲液清洗三次。 (12) 在二抗混合液(H R P 标记山羊抗小鼠和 A P 标记山羊抗兔) 中 孵 育 3 0 min (13) 用漂洗缓冲液清洗三次。 (14) 第一个抗体酶底物反应(A P 色原)5m in。 (15) 用漂洗缓冲液清洗三次。 (16) 第二个酶底物反应(H R P 色原)5m in。 (17) 蒸馏水清洗。 (18) 在 D A B 底物-色原中孵育 5min。 (19) M ayer7S 苏木精复染(通常在自动染色器外操作)。 (20) 用蒸馏水清洗切片。用稀释的氢氧化铵溶液蓝染切片。 (21) 用合适的封固剂封片。 结果 对 DAB-H R P 和固红-A P 而言,反应的颜色分别为棕色和红色。 注意事项 (1) 一抗的浓度至少是单独免疫组织化学方法中一抗浓度的两倍。 (2) 选择合适的颜色组合很关键,主要取决于组织切片中抗原的量和位置。 (3) 复染不应该覆盖免疫反应的颜色。 抗来源于同一动物的顺序双免疫酶染色法 [1«该方法的优点在于所使用的一抗可源于同一物种,然而操作起来较为繁琐,在一抗和二抗免疫反应之间需要有洗脱或阻断的步骤。 目前有市售的基于多聚体技术的试剂盒(如 EN VIS 〇 IO N 、Dako U S A 、Carpinteria、C A) 方法 (1) 切片用二甲苯或替代物脱蜡两次。 (2) 依 次 用 1 0 0 % 乙醇 (两次,每 次 5m in)、9 5 % 乙醇 (两次,每 次 5m in) 水化切片。 (3) 如果需要热诱导抗原决定簇修复或 37°C 酶法抗原修复,可在这一步操作。 (4) 将切片在缓冲液中放置 5m in。 (5) 封闭内源性过氧化物酶。 (6) 用缓冲液清洗切片。 (7) 室温下,蛋 白 酶 K 法抗原修复(如果需要),5m in。 (8) 将切片在非特异结合封闭液中孵育 10〜20m in。 (9) 不要清洗,将残留液体吹干(如果徒手操作可用滤纸吸干)。 (10) 将切片在未标记的一抗中赌育 30m in。 (11) 用漂洗缓冲液清洗三次。 (12) 在 E N V IS IO N 的过氧化物酶中孵育 30m in。 (13) 漂洗缓冲液清洗三次 (14) 用 DAB-色原试剂反应 5m in 。 (15) 用 D A K O 的双染封闭液洗脱,或 者 在 p H 6. 0 的柠檬酸缓冲液中煮沸 5m in。 (16) 漂洗缓冲液清洗三次。 (17) 将 切 片 在 非 特 异 封 闭 液 中 孵 育 1 0 m i n 。 (18) 不 要 清 洗 ,将 残 留 液 体 吹 干 (若 徒 手 操 作 可 用 滤 纸 吸 干 )。 (19) 再 用 抗 小 鼠 或 抗 兔 的 第 二 种 二 抗 孵 育 3 0 m i n 。 (20) 用漂洗缓冲液清洗三次。 (21) 在 ENVISION 或 AP 中 孵 育 30 min。 (22) 用漂洗缓冲液清洗三次。 (23) 用 固 红 显 色 A P 酶 活 性 5 〜 30 min。 (24) 用蒸馏水清洗。 (25) 用 Mayer』 s 苏木精复染。 (26) 水性封固剂封片。 结果 对 D A B -H R P 和固红- A P 而言,反应的颜色分别为棕色和红色。 注意事项 一般建议首先进行 H R P 与 D A B 显色反应,这个色原可以屏蔽第一套试剂,避免第一次和第二次染色反应间存在交叉。m
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实验步骤 |
间 接 免 疫 荧 光 技 术方法 (1) 用 pH7. 2 的 PBS 水化石蜡切片或冷冻切片 5 min。 (2) 擦掉多余的缓冲液,在一抗中孵育 30 min。 (3) 用漂洗缓冲液清洗三次。 (4) 在与荧光素结合的二抗中孵育 30 min。 (5) 用漂洗缓冲液清洗三次。 (6) 根据生产商的推荐,用合适的封固剂封片。 (7) 立即进行检测或将玻片避光低温保存。 结果 使用染料不同,抗原-抗体反应部位发出荧光颜色不同
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