标签: 单克隆抗体 腹水 杂交瘤细胞 抗体制备与使用实验指南 第六章
体内制备单克隆抗体前应首先采取杂交瘤细胞培养上清来鉴定感兴趣的单克隆抗体,冻存杂交瘤原代培养细胞,亚克隆1或2轮,重新筛选和冻存杂交瘤细胞的亚克隆。作者:霍华德,本实验来自「抗体制备与使用实验指南」
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实验步骤 |
一、材料小鼠: 2 或 4 只 B A L B /c雌性老年鼠 PristaneCSigma T-7640) Tuberculin 注射器 (I cc) 无菌针头(2 1 号) 台酚蓝染液,0.4% (Sigma T 8154) 无菌尖底离心管(15m l 或 50 ml) 无 菌 Dulbecco's 磷酸盐缓冲液(D-PBS) 二、设备细胞计数器 光学相差显微镜 台式离心机 三、时间要求4 只小鼠的Pristane 预刺激时间约需10min, 应在注射杂交瘤细胞前 10 〜14d 完成,但是不要超过3 周 。应提前培养杂交瘤细胞:准备注射用细胞大约需要 30 min,注射细胞大 概 需 要 10min。 四、 步骤 1.计划注射细胞前10〜14d 用 Pristane 预刺激小鼠。用手固定住小鼠,头部向下 2.注 射 前 1〜2d 用新鲜的培养基传代杂交瘤细胞以保证其处于对数生长期。用台 3.充分混匀杂交瘤细胞制成细胞悬液(取少量细胞悬液,如 30〜50jul)10倍稀释于台酚蓝+ D-PBS 混合液(I : 1 混合)并放置 5〜10min。将一滴稀释液移至血球计数板上 ,用光学相差显微镜计数存活的细胞并计算每毫升细胞悬液中活细胞数。 4.将含有所期望活细胞数量的细胞悬液加人15ml 或 50m l 的尖底离心管中,室温下 200 g 离 心 5 mm。弃上清后用室温下的 I>PBS 再次悬浮细胞,使其含量为 10 X106 个/ml。为保持细胞活性,应尽快将这些细胞注人小鼠体内。 5.用 带 有 21 号针头的无菌注射器吸取混勻的细胞悬液并向小鼠腹腔(L p.) 注射0. 5 ml,注射的位置和方法同 Pristane 预刺激部分 [见步骤(1)] 。 6.观察注射杂交瘤细胞后的小鼠 M h,且至少要在其后隔天观察其一般健康状况和腹水产生情况 五、腹 水 采 集1.材料无菌乙醇纱布垫 无菌针头(1 8 号) 无菌尖底离心管(15 ml) 无菌尖底离心管 (50 ml) 无菌巴斯德移液管 2.时间需求通常在注射杂交瘤细胞后的 7〜10d 小鼠腹水即可形成。收集和离心每次收获 (穿刺引流)的腹水大约需要 30 min。 7d 内每只小鼠最多行三次穿刺以收获腹水,并于最后一次收集后实施安死术。 3. 步骤(1)观察到小鼠中度腹胀时第一 次收获腹水 D 同样可以通过称量小鼠体重的方法计算出腹水的累积量。动物福利专家推荐,收获腹水前增加的体重不要超过基础体重水平的 20 % 。如果太早开始收获通常产量会减少,但如果不经抽取等到产生了过多腹水才允许收集, 则小鼠的窘迫和病死率将会上升。 (2)将预先准备好的无菌 15ml 尖底离心管平稳地放在合适的管架上。用手固定小鼠,尽可能多的抓住颈背部皮毛以便拉伸腹部皮肤。用无菌乙醇纱布垫消毒腹部。 (3)实施穿刺抽液术,用 1 8 号针头,倾斜,呈 45度角刺人下腹部腹中线的右侧,规避上腹部的脏器和腹中线附近的血管。针头要直接对准打开的离心管,因为液体可能在高压下喷出。或许,腹水也可能不易流出,此时需要轻柔挪动针头(包括旋转,改变针头刺入的深度和角度)以开始或继续引流。 (4) 通过针头收集尽可能多的腹水并小心将其转移。通常每只小鼠一次可收获 4〜6 ml 腹 水 ,但 可 在 2〜IOml 变动。如果腹水顺着针头流出或针头去除后腹水依然显著外 流 ,要将外流的腹水从针头注射点处滴入离心管中。轻轻按摩注射点周围腹部有助于腹水流出。应 格 外 注 意 的是 ,在 这 些 情 况 下 收 集 腹 水 过 程 要 无 菌 并 且 要 避 免 动 物窘 迫 。 (5)每次收获腹水时对注射相同杂交瘤细胞系的一组小鼠进行穿刺,收集的腹水可合并在一起。 1500 g 离 心 腹 水 10min 以沉淀并移除腹水中的细胞。如果腹水出现凝块,离心前用无菌巴斯德移液管在凝块和离心管侧壁间划动,使凝块与管壁分开。将腹水上清液转移至无菌 50 ml 离心管中并且于收获期间冻存在-20℃。 (6)将小鼠放回鼠笼并每日观察提示窘迫迹象的健康变化。如果健康状况衰落不明显 ,可再次实施穿刺抽液。再次穿刺抽液腹水需积累大约 48 h; 在第二次抽液 24〜48 h 后对小鼠实施安死术并进行第三次穿刺抽液。所有收获的腹水离心后可合并到同一离心管中。 (7)解冻腹水,用高速离心机离心使其澄清,纯化前去除脂质。经这种粗制的腹水可以作为抗体使用或用于进一步地纯化。为了长期保存,滴定抗体效价,并将腹水按每次使用量分装成小包装冻存于-70℃, 避免使用期间的反复冻融。 六、结果从每只小鼠中收集的腹水体积为 5〜10 ml。腹水中单克隆抗体的含量为 1〜10mg/ml, 即两 只 B A L B /c 小鼠可产 10〜20ml 腹 水 ,含 有 10〜200mg 抗体。不同杂交瘤细胞系之间和相同杂交瘤细胞系的各批次间的腹水产量可能不同。 |
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一、 材料小鼠:经 Pristane 预刺激的 4 只雌性老年 BALB/c 小鼠 PristaneCSigma T-7640) Tuberculin 注射器(Iml) 无菌针头(2 1 号) 无菌针头(30 号) 氢化可的松琥拍酸醋(hydrocortisone 21-hemisuccinate, Sigma H4881),6 mg/ml 溶于无 菌 D-P B S 中 杂交瘤细胞,5X106 个细胞/只小鼠 0.4% 的台酚蓝染液(Sigma T8154) 无菌尖底离心管(15 ml 或 50 ml) 无 菌 D-PBS 二、设备血球计数板 光学相差显微镜 台式离心机 铯同位素 y 射线照射器 三、 时间需求用 Pristane 预 刺 激 4 只小鼠需 lOmin。准备和注射氢化可的松琥珀酸酷需 45 min,7射 线 照 射 4 只 小 鼠 需 10min。杂 交 瘤 细 胞 需 提 前 培 养 :注射 用 细 胞 的 准 备 大 约 需 要30 min,细胞注射大约需用 10min。 四、步骤1.杂交瘤细胞注射前 U d 用 Pristane 预刺激小鼠 (见「小鼠的预刺激和杂交瘤细胞的注射」)。 2.杂父瘤细胞注射則二天,用 装 有 30 号 针 头 的 Iml Tuberculin 注射器在每只小鼠一条腿的臀部肌肉上注射 0.5m l 的氢化可的松琥珀酸酯。 3.杂交瘤细胞注射前 2d,用 550rad①亚致死剂量的 7 射线照射小鼠。 4.准备和注射杂交瘤细胞及收获腹水的步骤见「小鼠的预刺激和杂交瘤细胞的注射」和「腹水采集」。 五、结果 通常杂交瘤细胞在同种异型小鼠中的生长速度较同基因杂交瘤细胞在 B A LB /c小鼠中的生长速度要慢得多,即使同种异型小鼠是处理后为免疫缺陷或免疫抑制的。因此,腹水形成更加缓慢。通常小鼠在注射杂交瘤细胞后 10〜14d 就可准备第一次收获腹水(穿刺放液),但 如 果 30d 后仍无腹水产生,则表明操作失败。 |
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一、材料5 只 7〜8 周龄雌性无胸腺(nu/mi) 裸鼠 PristaneCSigma T-7640) Tuberculin 注射器(Iml) 无菌针头(2 5 号) 无菌针头(2 1 号) 杂交瘤细胞,5 X106 个细胞/只小鼠 0.4 % 的台酚蓝染液(Sigma T 8154) 无菌尖底离心管(15m l 或 50 ml) 无 菌 D-PBS 二、设备血球计数板 光学相差显微镜 台式离心机 三、时间要求Pristane 预刺激 5 只小鼠约需10min。 完成两次 Pristane 注射,第一次预刺激应在注射 杂 交 瘤 细 胞 前 12d 完 成 。杂 交 瘤 细 胞 需 提 前 培 养 :注射用细胞 的 准 备 大 约 需 要 用30 min,细胞注射大约需要用 10min。 四、步骤1.计划注射杂交瘤细 胞 前 12d,用 2 5 号针给每只小鼠注射0.5 ml Pristane 进行预刺激。腹腔注射过程与 BALB/c 小鼠的操作相似。 Pristane 更易顺着裸鼠无毛光滑皮肤上的针孔回流:简单地握住针头使针筒内无压力并将针头轻轻退出,这样操作对避免出现上述情况是必要的。 2.注射细胞前两天重复 Pristane预刺激步骤,Pristane 0. 2m l/只。 3.应提前培养,计数杂交瘤细胞,为注射作准备,方 法 同 BALB/c 小鼠腹水的制备。 4.用 带 有 2 1 号针头的无菌注射器均匀吸取备好的细胞悬液后向小鼠腹腔注射0.5 ml,注射的部位和方式与 Pristane预刺激的操作相同 [见步骤(1)]。 5.观察注射杂交瘤细胞后的小鼠 24 h 并且至少要在其后隔天观察其一般状况和腹水产生情况。 |
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一、 材料无菌乙醇纱布垫 无菌针头(1 8 号) 无菌尖底离心管(15 ml) 无菌尖底离心管 (50 ml) 二、时间需求通常杂交瘤细胞在无胸腺裸鼠体内的生长速度较在 BALB/c 小鼠体内的生长速度缓慢,因此腹水产生地更加缓慢。通常动物在注射杂交瘤细胞后的 10〜14d 可行腹水的第一次穿刺引流。收集和离心每次穿刺引流的腹水大约需要 30 min。 7d 内每只小鼠最多行三次穿刺收获腹水并于最后一次收集时实施安死术。 三、步骤见「腹水采集」步骤方案。 四、 结果每 只 小 鼠 收 获 的 腹 水 体 积 范 围 为 2 〜 5 ml。液 态 单 克 隆 抗体的含量范围为丄〜10 mg/ml,即 5 只无胸腺裸鼠可能产生 10〜20m l 腹水、10〜200m g 抗 体 。各杂交瘤细胞系间和相同杂交瘤细胞系的各制备批次间腹水的产量可能会有变化。
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一、材 料CELLine CL-1000 生 物 反 应 器 培 养 瓶 , Inegra Biosciense/ArgosTechnologies 公 司 加 人 2 mmol/L L-谷氨酰胺和 lOOU/m l 链霉素的IM DM 培养基 热灭活的胎牛血清(FBS) 杂交瘤细胞 50X106 无菌尖底离心管(15ml或 50 ml) 血清学移液管(25 ml) 无菌废液缸(如 1.5L 的玻璃烧杯或空培养基瓶) 0.4 % 的台酚蓝染液( Sigma T 8154) 无 菌 D-PBS 二、设备血球计数板 光学相差显微镜 台式离心机 CO2 培养箱 三、时间要求在生物反应器中接种杂交瘤细胞需要 20 min。每次收集细胞培养室的培养基和传代杂交瘤细胞以及更换营养供应室培养基需要30 min。如果操作很小心,杂交瘤细胞系可在独立的生物反应器瓶中生长 1〜3 个 月 ,至少每周更换培养基一次、以起始点的细胞数传代细胞以及收获抗体. 四、细胞接种步骤1.在抗体制备过程的所有步骤中,营养培养基和细胞室培养基在加入 C ELLine 培养 瓶 前 均 应 37℃ 预热。本 方 案 中 IM DM 是特定的,即杂交瘤细胞必须提前适应在稳定培养环境下生长,如应用于生物反应器中的培养基(如 RPM I、DMEM) 中生长。 2.在超净台中,将 两 室 CELLine 生物反应器从包装中取出。其 为 大 的 T 形 瓶 ,上层的营养培养基室容量为 1L ,可通过瓶颈部一个大的螺旋帽口进人。一个半透性醋酸纤维素膜使该营养培养基室与下层的细胞室分隔开。此膜允许两个腔室之间小分子的自由交 换 ,但阻止大分子扩散到细胞室外,确保将杂交瘤细胞分泌的抗体保留在细胞室。细胞室底部有一层硅胶膜,允 许 供 给 O2 和 替 换 CO2。细胞腔可通过吸量管从位于培养瓶顶部的开口进入,该开口里面装有密闭用的硅胶,瓶口可用螺旋盖帽盖住。 3.检查细胞腔入口的小螺旋帽是否拧紧。吸取含有 5% F B S 的 IMDM 50m l 加入营养培养基室中以平衡半透膜,至少静置 5 min。 4.杂交瘤细胞应在接种到瓶中前1〜2d 用新鲜培养基进行传代以确保细胞处于对 数 生 长 期 。接 种 当 天 用 台 酚 蓝 染 色 法 进 行 细 胞 计 数 ,并 保 证 活 细 胞 比 例 达 到90% 〜 100% 。 5.将 含 有 5 0 X 106 个杂交瘤细胞的一定体积的培养细胞悬液转移到一个 50ml尖底离心管中,在 200 g 离心力下,室 温 离 心 5min 后获得细胞沉淀。弃 上 清 后 用含 1 5 % FBS 的 IM DM 培养基轻柔地重悬细胞。 6.拧松营养培养基室人口大螺旋帽以避免(当加液体到细胞培养室时)空气闭塞而导致加人细胞腔中的液体回流。每次拧开小螺旋帽打开细胞培养室前都要进行此步操作。 7.用 25ml 吸量管吸取细胞悬液,取下细胞室开口的螺帽,移液管尖端伸进黑色细胞腔端口,将细胞轻轻接种于腔室中。然后将移液管尖端与端口处(硅胶层)压紧以保持密闭,立即将细胞悬液从腔室中吸回并在吸量管中轻轻提升,并将细胞悬液抽吸升到吸量管顶部,直至去除腔室中尽可能多的气泡。将细胞悬液移回腔室,气泡留在吸量管中,然后紧闭旋帽。 8.用一只手持住生物反应器(培养瓶),一端靠在超净台上,培养瓶呈半垂直 (45度角)位并使颈口对着超净台中心。严格按照无菌操作小心地向营养培养基室倒入 950 ml含 有 5 % FBS 的 IMDM。拧紧瓶口螺旋帽,封闭营养培养基室,将瓶子置于适合杂交瘤细胞系生长的最佳 CO2 及温度条件的培养箱中。 五、细胞室收集程序 通常首次收获抗体是在接种后的第 7 天进行,随 后 可 每 隔 5〜7d 收获一次。收获前细胞室中活细胞的数量应该达到 350X 106 个 。 2.将瓶子放回超净台,拧松营养室螺旋帽,然 后 取 下 细 胞 室 螺 旋 帽 。用 25m l的吸量管轻轻吸取细胞悬液。慢慢抽吸液体使其进出腔室几次以混勻瓶中的细胞悬液,注意总体积并保留 4m l或 20x106 〜100x106 个细胞于细胞腔中。如果出现下列情况留在细胞腔中细胞悬液的体积应进行调整:由于渗透通量的关系,细胞室中的体积与接种当天的体积相比已有增加;或 细 胞 生长不充分;或细胞的增长速度明显高于平均水 平 。 3.将收获的液体加入尖底离心管中,确定细胞的数量和活细胞比例,如果有必要,增加或减少留在细胞室中的细胞悬液量,然后拧紧细胞室开口的盖帽。将最终收获液在250 尽离心力下离心 10min, 使细胞沉淀。收获步骤完成时间越短越好,以保持细胞活性和最大限度地缩短因营养室空置后半透膜干燥的时间。 4.在收获液离心时,小心向营养室中倒人 I L 含 有 1 % 〜2 % FBS(根据第一周细胞生长是否良好,血 清 含 量 可 从 最 初 的 有 所 降 低)的 IMD M 来更换营养室培养基。如同接种步骤一样,松开营养室开口的螺旋帽,在细胞室中加入适当体积的含有 15% FBS的 IM DM 并去除气泡,使细胞室的体积恢复至 15 mU 拧紧细胞室及营养室螺旋帽并将 5.将从细胞室收获的上清转移至 50 ml 离心管中,冷冻保存在-80- -20℃。 6.每 隔 5〜7d 再进行相同的收获操作,收集液可合并一起保存。如果生物反应器 六、 结果 CELLine CL-1000 细胞室中的细胞密度可高达109 ,但最好争取保持适当的细胞密度从而使每次收获的活细胞数量大约为 500x106 个 。经 5〜8 周的培养,从 单 个 的 CL-1000 生物反应器中收集 100ml 培养上清,抗体含量为 0. 5〜 2 mg/m l。 通常培养第一周产生的抗体较之后的几周少,但这取决于细胞密度和各自杂交瘤细胞系抗体的产率。周期性地对每次收获抗体的含量进行测定以评估单克隆抗体产量的增加。细胞密度较高时,活细胞比例经常下降到 5 0 % 〜7 0 % ,但经常可在这种情况下得到最多的抗体。 |
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