一、固定
1.按照第一章例 2 的方法进行全身灌注,但换用甲醛盐水(在 0.85% 盐水中含 4% 甲醛).3
2.取脑,储存于新鲜的甲醛盐水中。
3.用单面刹刀手工切约 2 mm 厚的冠状切片。
二、脱水和包理
1.梯度乙醇脱水(70%、95% 和 100%),每 4 h 换 3 次,在组织清洁剂(nationaldiagnostics) 中每 4 h 换 3 次,或直至透明。
2.浸入融化的石蜡(55X:) 中,每 8 h 换 3 次进行包埋。
三、切片和染色
1.切 10um 的切片。
2.用组织清洁剂去除蜡,切片经梯度乙醇水化(100%、95% 和 70%)。
3.染色(注意本例中不同的切片分别用了几种不同的染色方法)。
尼氏颗较
(1)最原始的尼氏染色非常具有退行性,也就是说,组织先被过度染色然后分色,退行的技术仍然是许多现代方法的特征;
(2)用 0.1% 的醋酸焦油紫染色 20s(染色的时间取决于染料的来源、溶液的存放时间和 pH、组织的存放时间和其他可能的因素);
(3)梯度乙醇脱水(70%、95%和 100%), 用组织清洁剂使其透明;
(4)用 95% 乙醇分色以降低背景染色;
(5)100% 乙醇脱水完成,切片再用组织清洁剂透明。如需要,可以重复步骤 c。
髓鞘(Kieman1984b)
(1)用铬花青 R 染色 15~20 min[0.21mol/L 含水氯化铁 20 ml(5.6%w/w FeCl3.6 H20); 格花青 Rig;H2SO4(95%~98%w/w)2.5 ml; 力口水至 500 ml];
(2)流水去除多余的染料;
(3)氯化铁(5.6%) 分色;
(4)流水洗 5 min;
(5)可用 0.5% 核红衬染尼氏颗粒;
(6)梯度乙醇脱水(70%、95% 和 100%), 用组织清洁剂透明。
4.用 DPX 封片。
四、结果
用醋酸焦油紫染色后,神经元的核周体和近侧树突布满略带紫色的尼氏颗粒,神经元的常染色质核未着色,但每个神经元中单个突出的核仁染色较深。胶质细胞、室管膜和内皮细胞的异染色质核染色深,密度约与染色质浓缩的程度成正比。铬花青 R 染色后,髓鞘呈深蓝色,神经纤维网呈灰色背景。坏死的细胞和红血球染色较深,因此,充分的灌注固定对于染色结果至关重要。