为了确认 RTA 有利于稳定核糖体复合体,在对照实验中,我们通过点特异突变的方法改变了 RTA 功能氨基酸,得到 RTA 的突变失活基因。步骤如下:第 177 位的谷氨酸突变成谷氨酰胺;第 180 位的精氨酸突变成组氨酸;第 208 位的谷氨酸突变成天冬氨酸。这 3 个氨基酸的突变完全抑制了 RTA 的活性 [ 29,30 ] 。为了构建 pStAv-mR 和 pGST-mR 质粒,每个质粒(pStAv-R 或 pGST-R) 都采取标准的方法用 RTA 突变体基因替代 RTA 基因 [31],引物如下:5'-TTG CAT CCA AAT GAT TTC AAAGC AGC AC A C T T CCA A T A T A T TA G GGA G AA ATG-3' ( 下画线为 E177A 和 R180H 突变),以及 5'-G A T CCT AGC G TA A T T AC A C T T G AG G AT CCT AGCG T A A T T AC A C TT GA-3' ( 下画线为 E208D 突变)。
( 1 ) 将纯化后的 mRNA、4 μl 10 μmol/L RT 引物、每种 10 mmol/L dUTP 2 μl、4 μl 5X RT 缓冲液,用蒸馏水定容到 18 μl,根据供应商的推荐,不加 RNase 抑制剂和 ReverTra Ace。RT 引物用来(5'-G T G T A G C T T T G C A C A G T G G C -3' ) 识别 RTA 序列的上游部分。
( 2 ) 将混合物在 65°C 下放置 5 min 变性后,迅速放到冰上冷却。
( 3 ) 向混合物中添加 1 μl RNase 抑制剂和 1 μl ReverTra Ace。
( 4 ) 42°C 静置 1 h 进行反转录。然后 99°C 静置 5 min 将酶失活。
3.2.4 聚合酶链反应
用热稳定 DNA 聚合酶进行 PCR 反应。在我们的模式研究中,根据供应商的推荐,用 KOD Dash ( Toyobo) 进行 PCR 反应。