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标签：报告基因麦类作物转基因技术与田间鉴定实验指南第3章

报告基因实验可以用于：（1）植物分子生物学研究；（2）用以鉴别基因的表达模式；（3）在获得稳定转化植株的过程中也可用作转化细胞的标记。

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难度系数

4
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利用MUG检测 β-葡萄糖醛酸酶（GUS）
MUG 荧光分析
GUS 活性的组织化学检测
植物提取物中LUC活性的检测
利用冷型 CCD 像机进行 LUC 的活体检测
荧光蛋白（FP) 的显微检测
花青素表达的定量

实验方法原理	报告基因是一个分子生物学概念，它是指一类在细胞、组织/器官或个体处于特定情况下会表达并使得他们产生易于检测、且实验材料原本不会产生的性状的基因。作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：①已被克隆和全序列已测定；②表达产物在受体细胞中本不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；③其表达产物能进行定量测定。
实验材料	组织样品
试剂、试剂盒	GUS 缓冲液
仪器、耗材	离心机
实验步骤	一、完整组织的提取 1. 取少量（5~50 mg ) 叶片、根、愈伤等组织样品，所需样品量由材料决定。 2. 离心管中加入 GUS 缓冲液（50~200 ul），组织匀浆。 3. 16000 g，4℃ 离心 15 min，沉淀破碎的细胞。 4. 检测提取物的蛋白质浓度。 5. 用 GUS 缓冲液稀释提取物，使蛋白质总浓度为 0.1 mg/ ml。 6. 立即使用提取物，或者 -80℃ 保存。二、原生质体制备 1. 通过离心（50 g，1 min），小份（1x10⁶）收集转化的原生质体，用 2 ml 的 3 M 缓冲液重悬。 2. 取一份原生质体，用血细胞计数板计数。 3. 将剩余的原生质体 50 g 离心 1 min，用 150 ul 的 GUS 缓冲液重悬，短暂涡旋（或者通过 26 G 的抽吸），静置 5 min。 4. 离心（16000 g，4℃ 15 min ) ，使细胞碎片沉淀。检测提取物的蛋白质浓度，参照完整组织样品的方法对其进行稀释。
其他	本实验来源「麦类作物转基因技术与田间鉴定实验指南」〔英〕H.D.琼斯 P.R .休里主编。

实验材料	组织提取物
试剂、试剂盒	GUS 缓冲液 MUG
仪器、耗材	96 孔板数显荧光计
实验步骤	1. 分别取 25 ul 和 50 ul 组织提取物样品于 96 孔板中（黑色或者白色），包括未转化的对照组织，加 GUS 缓冲液至总体积为 200 ul，混匀。 2. 加入 100 μl 含 2.5 mg/ml MUG（终浓度为 2 mmol/L ) 的 GUS 缓冲液以开始反应，混匀，加盖。 3. 37℃ 温浴，反应 5~10 min。取 50 μl 反应液加入另一个含有 200 ul 0.2 mol/L Na₂CO₃的微型板中，以终止反应。然后按照合适的时间间隔（10 min、20 min、30 min 或 1 h ) ，再取 50 ul，进行相同的操作。 4. 在 365 nm 的激发光、455 nm 的发射光下，用数显荧光计测量 MU 产物的荧光量。检测样品产生的线性动力学关系，蛋白提取物稀释值及重复测量的荧光量是否相对应。 5. GUS 活性可以用 pmolMU / min / mg 蛋白来表示。其中 MU 标准物按照荧光读数器线性关系的浓度（如 0~5 umol/L )，通过 0.2 mol/L 的Na₂CO₃溶液稀释，并置于板上。1 mmol/L 的 MU 甘油溶液应 4℃ 保存，使用前检测有无 Na₂CO₃的沉淀。或者，荧光活性也可以用荧光单位（flu) / ng 蛋白/min 表示。要把这个值转化为 UidA 蛋白的量，需要用纯化的 GUS 酶（E.coli VII- A，Sigma ) 绘制标准曲线：用 GUS 缓冲液稀释 GUS 酶至 0.1 ng/ul 的工作浓度，在总体积为 50 ul 的 GUS 缓冲液中加入 0~2 ng 的 GUS 酶，按照上面的步骤进行分析。 6. 有些植物组织含有高水平的内源性 GUS 活性，但可以优化反应条件来检测这些组织的 GUS 活性。

实验材料	组织
试剂、试剂盒	HGUS 缓冲液磷酸盐缓冲液乙醇溶液
仪器、耗材	微量滴定板或者试管
实验步骤	1. 将组织置于新配制的 HGUS 缓冲液中（含有 X-Gulc 及其他添加物），足以完全浸没材料，试验在微量滴定板或者试管中进行。 2. 吸真空 5~10 min，然后去掉真空条件。 3. 铝箔包裹，37℃ 放置 48 h。 4. 用 100 mmol/L 的磷酸盐缓冲液（pH 为 7.0）洗脱材料。 5. 为了清洗材料以便观察，在 25% 的乙醇溶液中孵育 15~30 min，在 50% 的乙醇溶液中孵育 15~30 min，在 75% 的乙醇溶液中孵育 30 min。 6. 最后，在 90% 的乙醇溶液中（期间更换几次）37℃ 孵育 2~4 h，或者直到所有的叶绿素去掉为止。 7. 样品可以无期限地保存在 90% 的乙醇溶液中。盖紧盖子，避光室温放置，但要经常监测乙醇的含量。

实验材料	植物组织
试剂、试剂盒	裂解液萤光素酶分析缓冲液
仪器、耗材	离心机
实验步骤	一、完整组织 1. 液氮速冻植物组织（5~50 mg)，研磨成粉末状。 2. 100~400 ul 裂解液室温重悬，组织匀浆。 3. 16000 g，4℃ 离心 15 min，弃掉破碎的细胞。 4. 检测提取物中的蛋白质浓度。 5. 立即使用提取物，或者 -80℃ 保存。二、原生质体 1. 50 g 离心 4 min，小份收集（1 x10⁶ ) 原生质体。 2. 用 2 ml 的 3M 缓冲液重悬，50 g 离心 4 min。 3. 400 ul 裂解液重悬，短暂涡旋（或者通过 26G 的抽吸）。 4. 16000 g，4℃ 离心 15 min，沉淀破碎的细胞。检测提取物的蛋白质浓度。三、萤光素酶的检测 1. 取 20 ul 分装的组织提取液于不透明的微型板，以未转化组织的提取物作对照。 2. 设置光度计程序，加入 100 ul 萤光素酶分析缓冲液，等待 2s，在 10s 内读出萤光素酶的活性值。反应的光强度接近常数的时间约为 1 min，然后慢慢衰减，半衰期大约 10 min。如果光是充足的，读数时间也会缩短。 3. 用荧光单位 flu /10 s/ mg 表示活性，或者参照提纯的 LUC ( 用来制作标准曲线）的表示方法。 4. 经常会使用第二种报告基因（内参对照）如 GUS 进行瞬时表达分析，其检测结果再与对照报告基因的表达对比和进行标准化。需要注意的是，有报道说当植物组织用萤光素酶裂解液提取后，GUS 会被完全激活，但是GUS 缓冲液会影响到 LUC 的活性。第二点需要说明的是，对照载体既不会影响被检测载体的表达，也不会受到培养条件的影响。一般而言，在基因枪转化或者电激转化前，通过以 1：10 的比例混合对照载体与被检测载体，使得对照载体的表达量保持在较低水平。另外要知道瞬时表达实验需要多次重复，以对数据的统计相关性进行分析。

实验材料	LUC
试剂、试剂盒	D- 萤光素水溶液
仪器、耗材	液氮冷却相机
实验步骤	对于萤光素酶的检测来说，需要解决荧光素渗透进入活体组织这一问题 [7]。多数情况下，用荧光素溶液简单地喷洒植物就可以解决，但是一些组织，如发育后期的种子不能吸收荧光素，需要产生伤口（见注 27 ) 以利于底物进入 [52, 53 ]。通过组织提取或者原位杂交的方法，植物中 LUC 活性的明显缺失应该很容易得到确定 [7, 54]。因为伤口会影响荧光素-O2 的动态平衡，即使是重复喷洒荧光素之后达到了平衡，也难于利用 LUC 来研究受创伤影响的基因表达。尽管O₂和Mg²⁺ 一般不会限制萤光素酶的活性，但是在特殊情况下，如植物组织被淹没时，O₂ 含量会成为限制因素，随之导致产光量的降低 [7]。生长在不同氧合水平下的细胞悬浮培养物被检测到不同水平的 LUC 活性。 1. 材料的准备 (1) 用喷雾器将 1~5 mmol/L 的 D- 萤光素水溶液直接喷洒到整个植株上，使其完全湿润（见注 2 7 ) 。100 mmol/L 的 D- 萤光素水溶液小份分装，-20℃ 保存，用前进行稀释。 (2) 在图像采集前的 24 h 、16 h 、4 h、2 h , 重复上述的萤光素喷洒实验。 2. LUC 的活体检测捕捉低强度发射光最简单的方法是通过 X 射线或感光胶片将表达萤光素酶基因的整个植株压在 X 射线胶片上，就可以获得该植株的照片，尽管这种图片的分辨率不高，但是它显示了基因表达的位置。因此，对于大多数实验来说，必须要购买一台敏感性的 CCD 成像系统。常用的 CCD 系统有两种类型：慢速扫描液氮制冷 CCD 成像系统和增强 CCD 成伐系统。制冷 CCD 系统一般可以提供更高的时空分辨率 [9 ]，但它对超过 500 nm 的波长有更局的敏感性（见注 29) 。其中的一种成像系统是利用硅晶片，它能在受到光子轰击后发射出电子。一个单独的像素发出的电子通过电子方法进行定量，从而产生图像。发出的电子数以灰度等级单位（gsu) 表示。像 MetaMorph 这样的软件，能够将这些 gsu 值转换为边界值范围内的伪彩色图像，所以可以对设定区域的荧光水平进行定量。但实际上，很难得到整个植株的图像，因为叶片以及其他器官的方向也会影响检测的信号。图 3.1 (b ) 显示的是启动子- LUC 拟南芥转化植株茎、茎生叶、正在发育的花芽上部的表达情况。该照片是用 Princeton Instruments 公司生产的慢速扫描液氮制冷 CCD 成像系统配以尼康 50 mm 的镜头拍摄，曝光时间 3 min。它是一个伪彩色图像，由 MetaMorph 软件制作，蓝色代表低强度像素，红色代表高强度像素。 (1) 液氮冷却相机，达到 -120℃ 的工作温度（见注 30)。 (2) 在捕捉图像前的 10~20 min，用萤光素喷洒材料。 (3) 将植株或者离体的叶片、茎、根放在载物台上，开启后灯，对焦，根据说明捕捉图像。 (4) 关灯，将材料置于完全黑暗中 5~10 min (见注 31）。 (5) 在 1~30 min 捕捉图像（见注 32)。 (6) 利用图像软件计算图像的光强度（见注 33)。

实验材料	活体组织
仪器、耗材	落射荧光显微镜汞灯
实验步骤	表达突光蛋白的材料一般首先用落射荧光显微镜（epi-fluorescent microscopy) 来观察，尤其当研究表皮上表达的荧光蛋白或者用反褶积软件去掉从焦点之外采集的荧光时[18]。然而，对于较厚的材料，必须使用共聚焦显微镜，因为它可以穿过产生荧光的样品，深入材料 50 um 或更厚的地方，从而产生很薄的（0.5~1.5 um ) 光切片。此外，如果对多种荧光蛋白成像，共聚焦显微镜也十分有用，它可以同时检测多种发射波长（参见注释 3 4 )。共聚焦显微镜的主要缺点是使用激光照射样品，因为通常可用的激光激发波长范围有限，所以激发波长必然会与激发效率相冲突，而激发效率取决于发色团的物理特性，虽然只需要 25% 的激发效率，但是 80% 或者更高的效率更合适。正确选择滤光片非常重要（见注 35 ) ，不管使用哪种显微镜，次优的滤光片都会导致所观察到的荧光蛋白亮度明显降低；相反，它需要增加曝光的时间和光照强度。这不仅影响了荧光蛋白的光稳定性，所有的荧光蛋白会很快被漂白，而且也会影响到细胞的活性。各公司出售不同的滤光片组件，作为一系列显微镜的配件，因为要选择最适合的滤光片，以符合特定荧光蛋白变体的要求，当然，最理想的是配备各种不同的滤光片组件 [16, 55]。荧光蛋白用作报告基因时，应当注意细胞的一系列代谢物和结构组分发出自身荧光的问题，这种荧光一般被称为自发荧光。由于自发突光谱很广，常常包含了大部分可见光，所以不可避免地会与 GFP，以及其他荧光蛋白的发射光谱相重叠。在植物材料中，自发荧光最主要的来源是叶绿素、多酸类、木质素、纤维素和液泡组分，但是培养基和一些固定方法会产生高强度干扰性自发荧光。精心地选取特定荧光蛋白变体和滤光片，可以减少观察个别组织时遇到的各种麻烦（见注 36 ) , 此外，当表达量很低，且研究入员经验不足时，很重要的一点是将转基因与非转基因材料对比观察。为了提高荧光蛋白的检测效果，许多实验室构建载体将荧光蛋白用于亚细胞定位，其好处是将信号集中在低水平扩散的荧光背景，产生可清晰观察的图像。这种模式与低水平扩散的荧光截然相反，就样品的自发荧光而言，荧光蛋白的光谱特性并未有多大区别（见注 37 )。另一种增强 FP 检测效果的方法是遗传级联效应。FP 与其他报告基因的不同在于其检测过程中没有建立酶的级联放大效应，这就意味着该检测方法比 GUS 或者 LUC 的检测敏感性更低。所研究的启动子与反式激话蛋白如 ga14 : vp16 相融合，荧光蛋白受顺式元件控制，反式激活蛋白又与顺式元件结合，这样便提供了级联效应的一种方法[43]。图 3.1 (c ) 显示的是发芽中的小麦种子，它源于稳定导入了水稻「 actin 启动子-GFP」载体的转基因植株。GFP 是 sGFP S65T 变体，图像在莱卡 MZF1MZH Ⅲ 型荧光立体显微镜下拍摄，该显微镜安装了莱卡 DFC300FX 数码相机，并配备莱卡 GFP2 型滤光片(见注 42) 。 (1) 首先用落射荧光显微镜观察材料。 (2) 打开汞灯（见注 38) ，首先检查光阑是否在原位。 (3) 将活体组织（整体包埋或切片的材料）置于载物台上（见注 39~42) 。 (4) 用透射光聚焦显微镜。 (5) 选择滤光片（见注 43 ) , 移开汞灯光阑，观察样品（见注 44)。 (6) 根据需要捕捉图像（见注 45）。 (7) 如果需要的话，可以使用共聚焦显微镜观察材料（见注 46)。

实验材料	植物组织
试剂、试剂盒	酸性乙醇或甲醇花青素-3-O-葡萄糖苷
仪器、耗材	滤膜
实验步骤	1. 瞬时表达研究植物组织经基因枪转化培养大约 12 h 后，转化细胞开始表现出深红色或者偶尔为深蓝色的斑点。颜色常常会向整个液泡扩散，从外表上看整个细胞都是红色的。在几天时间里，颜色将会增强，并且能在 1~2 周内保持稳定。对于有些细胞来说，其深色液泡内含物中的花青素或者 AVI [ 27 ] 会隐退，或者随着时间的推移慢慢地沉积下来，在这种情况下个体转化细胞更难以判断。尽管大量的细胞积累花青素后，可以用肉眼观察，但是统计转化细胞数目需要一台低倍立体显微镜。小麦品种 Cadenza 还在发育的糊粉层细胞，瞬时表达转化小麦 8S 球蛋白启动子控制的玉米 C1 和 R-Lc 基因。只有这两种载体 DNA 按相同摩尔数混合并通过基因枪转化，才能看到花青素积累。培养 3 天后，利用莱卡 MZ8 型立体显微镜拍摄，该显微镜配备莱卡 DFC300FX 型数码相机。 2. 通过吸收光谱对植物提取物花青素进行定量通过组织提取、535 nm [ 56 ] 处光吸收值等方法，或者通过图像分析来对花青素定量 [57]。可以通过高效液相色谱（HPLC ) 对各种花青素进行定量分析和种类鉴定，或者通过蒸发，将相同的植物提取物浓缩，利用液相色谱质谱（mass spectrometry ) 联用（LC- MS) 技术进行鉴定 [58]。 (1) 取 200 mg 样品于 3 ml 酸性乙醇或甲醇中（乙醇与 0.1 mol/L 的 HCl 的体积比为 85 : 15，pH 1.0），匀浆组织。 (2) 用 4 mol/L 的 HCl 调 pH 至 1.0，用力振荡 30 min。根据需要，重新调 pH 至 1.0。 (3) 重新振荡 30 min，27000 g，5℃ 离心 15 min。 (4) 将提取物置于 5℃，48 h，27000 g，5℃ 离心 15 min，然后用 0.45 μm 滤膜过滤。 (5) 加酸性乙醇至体积为 3 ml。 (6) 用溶剂设置空白对照，测量 535 nm 处的吸光值，计算花青素总含量。购买合适的标准花青素如花青素-3-O- 葡萄糖苷，绘制标准曲线；参照曲线，对样品中的花青素含量进行定量。 3. 通过成像分析定量花青素可以通过成像分析，测量色素强度，从而对花青素进行定量。 (1) 取 1 ul 溶于酸性乙醇的已知浓度的系列花青素-3-O-葡萄糖苷（0~400 ug/ml）于载玻片上，用数码相机采集图像色彩强度和色素与花青素-3-O-葡萄糖苷之间的相关系数通过合适的软件进行处理。 (2) 参照上述操作，在相同条件下采集样品图像。