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制备肌动蛋白实验

标签: 制备肌动蛋白 细胞实验指南 第3章 第28节

本实验来源「细胞实验指南」 黄培堂 等译。

实验方法
  • 从肌肉制备丙酮粉用于纯化肌动蛋白
  • 由骨骼肌丙酮粉制备肌动蛋白
  • 将肌动蛋白纯化成纯品
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
1. 抽提肌球蛋白时得到的沉淀物用 3 倍于沉淀物体积的肌球蛋白抽提溶液抽提 10 分钟。

肌球蛋白抽提溶液:

0.5 mol/L KCl

0.1 mol/L K2HPO4

2. 抽提物离心(GSA 转头,13000 r/min,17310 g)15 分钟,去掉上清。

3. 在肌肉残渣中加 1 L 冷的 dH2O,搅拌,然后用 1 mol/L Na2CO3 调 pH 到 8.2~8.5。

把混和物分到 6 个 250 ml 的瓶中,离心(GSA 转头,13000 r/min,17310 g)15 分钟离下含肌动蛋白的不溶物。

4. 去掉上清。然后如步骤 3 所述再次离心。倒掉上清并用合适的记号笔画出沉淀物的轮廊(这可以在以后的步骤中确定什么时候沉淀物开始涨大)。加足量冰冷的 dH2O 装满离心瓶以重悬沉淀物。大概重复 4 次直到沉淀物开始涨大。

5. 沉淀物一开始涨大,不管用水洗的次数是多少,都接着进行下个步骤。

6. 在 250 ml GSA 离心桶中用冰冷的丙酮重悬肌肉残渣,剧烈搅拌大约 20 分钟。

7. 离心(CSA 转头,13000 r/min,17310 g)沉淀 15 分钟并去掉上清。此外,沉淀可以在 Bounce 漏斗上过滤。

8. 重复步骤 6 和 7。

9. 把沉淀的蛋白铺在滤纸上(例如 Whatman 3MM ) 并让它在室温过夜干燥。

10. 第二天,如步骤 6 所述的那样,把干了的丙酮粉重悬在氯仿里并离心以去掉多余的脂肪。过滤并干燥沉淀。
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实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
1. 准备贮存液和材料

0.1 mol/L K+ATP,pH 7.0

0.1 mol/L DTT(冻存在 -20℃,避免反复冻融)

0.1 mol/L CaCl2

0.1 mol/L Tris-HCl,pH 8.0

肌动蛋白解聚缓冲液(惯称冷缓冲液 A):

2 mmol/L Tris-HCI,pH 8.0

0.2 mmol/L ATP

0.5 mmol/L DTT

0.2 mmol/L CaCl2

该缓冲液可以配制成不含 CaCl2 的 50x 贮存液并冻存(-20℃ )。

2. 10 g 肌肉丙酮粉(用上文方法制备)和 200 ml 缓冲液 A 混合并在 0℃ 搅拌抽提 30 分钟。

3. 不溶的碎片离心(SS-34 转头,16000 r/min,19950 g)10 分钟。

4. 保留上清,0℃ 下在 20 ml 缓冲液 A 里重新抽提沉淀物 10 分钟。

5. 再次离心(步骤 3 );把两次离心得到的上清混在一起并测量体积。

6. 边在烧杯里搅拌,边加适量体积的贮存溶液使抽提物中含 50 mmol/L KCI,2 mmol/L MgCl2 和 1 mmol/L ATP。

7. 在 4℃ 聚合 2 小时。

8. 在冰库放 90 分钟。

9. 边搅拌边使 KCl 浓度达到 0.6~0.8 mol/L 以去除原肌球蛋白。

10. 在冰库里缓慢搅拌 30 分钟。

纯化肌动蛋白丝

11. 超速离心(50Ti 转头,35000 r/min,81000 g)3 小时以沉降丝状的肌动蛋白。

12. 去掉上清并用含 0.6 mol/L KCl 的缓冲液 A 轻轻地洗沉淀的表面。为了去掉夹杂在肌动蛋白沉淀中的污染物,沉淀物在含 0.6 mol/L KCl 的缓冲液 A 中进行匀浆。超速离心(50 Ti 转头,35000 r/min,81000 g)3 小时以再次沉降肌动蛋白。

13. 超速离心管中挖出沉淀物并放到一个玻璃匀浆器中。最大限度地把丝状肌动蛋白从管子转移到匀浆器中,接着(例如在转移了沉淀物后)在每个管子中加 1 ml 缓冲液 A 并孵育 1 小时。收集在缓冲液 A 中残余的肌动蛋白,加到匀浆器中,另外再加缓冲液 A 使加入的缓冲液 A 总体积为 30 ml。用带紧的研杵的 Dounce 牌匀浆器在缓冲液 A 中分散沉淀物,然后把匀浆物加到直径 1 cm 的透析管中。

14. 透析 1.5 天,换 3 次缓冲液 A。在充分搅拌的溶液中,KCI 透析一半的时间大约是 5 分钟,所以额外多换几次液会有帮助。对肌动蛋白丝进行机械破坏也会加速肌动蛋白丝的解聚。

15. 超速离心(50Ti 转头,35000 r/min,81000 g)3 小时使 G-肌动蛋白溶液变清。

16. 测量肌动蛋白浓度。
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实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
1. 准备 2~8 mg/ml 溶在缓冲液 A 中的常规肌动蛋白。

2. 10 ml 常规的肌动蛋白上样到凝胶过滤柱(2.5cm x 50cm Sephadex G-150 柱,用缓冲液 A 平衡)。

3. 肌动蛋白样品进入凝胶后,上面加缓冲液 A,并且用 275 ml 缓冲液 A 跑柱子。

4. 以每管 5 ml 作分部收集。

5. 收集液通过 OD260 和 SDS-PAGE 检测肌动蛋白。
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