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纯化DNA实验

标签: 纯化DNA 细胞实验指南 第3章 第22节

本实验来源「细胞实验指南」 黄培堂 等译。

实验方法
  • 从哺乳动物细胞或组织分离DNA
  • 基因组DNA的快速纯化
  • 纯化质粒(碱裂解法)
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
1. 根据样品类型,从下列方法中选一个作为步骤 1 进行操作。

(1) 细胞样品

① 单层培养的细胞

以用冰预冷的 TBS 将单层细胞洗涤 2 次,用刮棒把细胞刮入约 0.5 ml 的 TBS 中,将细胞悬液转移到冰浴的离心管中,用 1 ml TBS 冲洗培养皿,并入离心管中的细胞悬液。于 4℃ 以 1500 g 离心 10 分钟以收获细胞。用 5~10 倍体积经冰预冷的 TBS 重悬细胞并再度离心。用 TE ( pH 8.0)重悬细胞,使细胞密度为 5x107 细胞/ml,转移至一个三角烧瓶中(1 ml 细胞悬液用 50 ml 烧瓶;2 ml 则用 100 ml 烧瓶;余类推)。每毫升细胞悬液加入 10 ml 抽提缓冲液,在 37℃ 孵育 1 小时,随后进行步骤 2。

抽提缓冲液:

10 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0

0.1 mol/L EDTA,pH 8.0

20 μg/ml 胰 RNA 酶

0.5% SDS

② 悬浮生长的细胞

于 4℃ 以 1500 g 离心 10 分钟以收获细胞。用与原培养液等体积的经过冰预冷的 TBS 重悬细胞,再次离心收获细胞并重复洗涤步骤。用 pH 8.0 的 TE 重悬细胞使密度为 5x107 细胞/ml。将悬液转移至大小适当的烧瓶中,依前听述加入抽提缓冲液并孵育。

(2) 组织标本

将刚切制的组织碎块放到盛有液氮的 Waring 绞切器的不锈钢杯中,以最高速度绞切至组织粉碎成为粉末。待液氮蒸发,将组织碎末一点一点地加入到盛有近 10 倍体积抽提缓冲液(如前)的烧杯中。使粉末分散在抽提缓冲液的表面,面后振摇烧杯使粉末浸没。待其完全分散于溶液中后,将该溶液转移至 50 ml 离心管中,37℃ 孵育 1 小时。随后进行步骤 2。

(3) 血液标本

收集约 20 ml 新鲜血液,加入装有 3.5 ml 酸性柠檬酸葡萄糖溶液 B ( ACD ) 的试管中 。这一抗凝剂优于 EDTA,因为它在血液贮存过程中更能保存高分子量 DNA。这些血液在制备 DNA 前可于 0℃ 保存数天或于 -70℃ 长期保存。配制 ACD 时,混合:

柠檬酸              0.48 g

柠檬酸钠          1.32 g

葡萄糖             1.47 g

加水至 100 ml

用作抗凝剂时,每 6 ml 新鲜血液中加入 1 ml ACD。

新鲜血液(20 ml):以 1300 g 离心 15 分钟,弃上层血浆,用巴斯德吸管将淡黄层小心移到另一管中并再次离心。淡黄层即为密度不均一的白细胞宽带。将经第二次离心的淡黄层重悬于 15 ml 抽提缓冲液中,37℃ 孵育 1 小时,随后进行步骤 2。

冻藏血液(20 ml):在室温水浴中融化,移至离心管中,用等体积 PBS 稀释;随后于室温以 3500 g 离心 15 分钟并弃去上清液,其中含有已溶解的红细胞用 15 ml 抽提缓冲液重悬沉淀物;37℃ 孵育 1 小时,随后进行步骤 2。

2. 蛋白酶 K 至终浓度为 100 μg/ml,用玻棒温和地将酶混入黏稠的溶液中。

3. 裂解细胞的悬液置于 50℃ 水浴中 3 小时,不时悬动该黏稠溶液。

4. 溶液冷却至室温,如有必要就将溶液倒入离心管。加等体积经 0.5 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)平衡的酚,缓慢地来回颠倒离心管 10 分钟以轻轻地混合两相 。如此时两相未能混合形成乳浊液,则将离心管置于旋转器上 1 小时,于室温以 5000 g 离心 15 分钟,使两相分开。

5. 大口径移液管(出口直径为 0.3 cm ) 将黏稠的水相移至一洁净的离心管中并用酚重复抽提 2 次。

6. 分离高分子量 DNA ( 约 200 kb ):第三次酚抽提后用全部水相于 4℃ 对 4 L 50 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.0)、10 mmol/L EDTA ( pH 8.0 ) 溶液透析 4 次,直至透析液的 OD270 值小于 0.05。让透析袋留有使样品体积增至 1.5~2.0 倍体积的空间。下转步骤7。

分离大小为 100~150 kb 的 DNA:第三次酚抽提后,将全部水相移至另一离心管中并加 0.2 倍体积的 10 mol/L 乙酸铵。在室温下加 2 倍体积乙醇并转动离心管使溶液充分混合。DNA 立即形成沉淀,通常可用制成 U 形并经封口的巴斯德吸管将沉淀从乙醇溶液中移出。而大部分污染的寡聚核糖核苷酸仍留在乙醇溶液中。如果 DNA 沉淀成为碎片,则在吊桶式转头中于室温以 5000 g 离心 5 分钟收集 DNA。用 70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀 2 次,并按上述条件离心收集 DNA。尽可能彻底地除去 70% 乙醇,于室温将 DNA 沉淀置于一个敞幵的管内,直至可见的痕量乙醇挥发殆尽。不要使 DNA 沉淀完全干燥,否则极难溶解。

大约按每 5x106 细胞加 1 ml TE (pH 8.0 )。将管子放在摇床平台上慢慢摇动直至 DNA 完全溶解。这通常需要 12~24 小时。

7. 测定 DNA 样品在 260 nm 和 280 nm 处的光吸收。A260 与 A280 之比应大于 1.75。低于此值则表明制备物中留有大量蛋白质。在这种情况下,应加入 SDS 至终浓度为 0.5%,并重复步骤 2~7。

8. 计算 DNA 浓度,进行脉冲电场凝胶电泳或通过铺在 1% 琼脂糖支持层上的 0.3% 琼脂糖凝胶电泳分析小量样品。大于 100 kb 的 DNA,其迁移率应该比完整的 λ 噬菌体 DNA 的线性二聚体分子慢。将 DNA 贮存在 4℃。
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试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
第 1 天

1. 大约 1.5 cm 长的尾部活检样品放在一个 1.5 ml 盛有 0.7 ml 尾部缓冲液的小离心管中,加 35 μl 10 mg/ml 蛋白酶 K,在 55℃ 振摇温育过夜。

尾部缓冲液(配 25 ml)

50 mmol/L Tris,pH 8                           1.25 ml 1 mol/L Tris,pH 8

100 mmol/L EDTA,pH8                        5 ml 0.5 mol/L EDTA,pH 8

100 mmol/L NaCI                                  0.5 ml 5 mol/L NaCI

1% SDS                                              1.25 ml 20% SDS

存放于室温。

蛋白酶 K:10 mg/ml 水溶液,贮存于 -20℃。

第 2 天

2. 加 7 μl 10 mg/ml RNA 酶(不含 DNA 酶),在 37℃ 孵育 1~2 小时。

3. 在微量离心机中对样品离心 20 分钟以沉淀鼠毛。

4. 小心转移 0.5 ml 上清,注意不要搅动沉淀。

5. 在管子中加 0.5 ml 异丙醇并通过翻转轻轻地进行混合。应该立即有线状沉淀形成。

不要剧烈混合。不要使 DNA 形成紧密团块,否则会难以绕缠。

6. 在 Bunsen 灯的火焰上加热封闭 100 μl 玻璃小吸管的末端。

7. 把末端封闭的小吸管浸到 DNA 溶液中并剧烈搅拌来缠绕 DNA。一直搅动吸管直到 DNA 紧紧地缠绕到上面。

8. 洗 DNA 是在三个顺序排列的盛大约 50 ml 乙醇的烧杯中各浸 10 次(1 个是 70% 乙醇,另 2 个是 100% 乙醇)。洗 5~8 个样品后换洗涤溶液。

9. 用一片胶带标记玻棒末端,把它插在(DNA 端朝上)一块橡皮泥,使风干 10~15 分钟。

10. 用钻石记号笔在黏附了 DNA 的那一末端刻线,弄断玻棒,把带 DNA 的那段放到已作标记的微量离心管中。

11. 加 0.5 ml TE ( pH 8 )。样品在室温下振荡过夜。

第 3 天

12. 稍稍振荡管子,用干净镊子拿掉玻璃棒(在不同样品的操作之间烧一下镊子): 继续振摇 1~2 小时。(如果样品只是用来进行 PCR 分析,玻棒可以留在管子里)。

13. 以 1:10 稀释样品,测 OD260 值以确定浓度(1 OD260=50 μg/ml).

14. DNA 贮存在 4℃。
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实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
1. 单个大肠杆菌克隆接种到 2 ml 含适当抗生素的 LB 中。37℃ 剧烈振荡孵育 5~8 小时。或者可以培养过夜使饱和。

2. 倒 1.5 ml 培养液到已作标记的微量离心管中。把剩下的培养液存放在 4℃。

3. 在微量离心机上离心 2 分钟以沉淀大肠杆菌。吸掉培养液。

4. 用 100 μl 葡萄糖缓冲液重悬沉淀物。在室温孵育 5 分钟。在这时候充分悬浮大肠杆菌对于获得尽可能大的产量是很重要的。

葡萄糖缓冲液(配 500 ml)

50 mmol/L 葡萄糖                    4.5 g 葡萄糖

10 mmol/L EDTA,pH 8.0       10 ml 0.5 mol/L EDTA,pH 8.0

25 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0   12.5 ml 1.0 mol/L Tris-HCl,pH 8.0

过滤除菌,贮存在 4℃。

5. 在管中加 200 μl NaOH-SDS 溶液,轻轻地颠倒混合。冰浴 5 分钟。溶液应该明显变清了,但仍然非常黏。

NaOH-SDS 溶液(配 50 ml)

0.2 mol/L NaOH               0.4 g NaOH

1% SDS                           2.5 ml 20%  (w/v)  SDS

可在室温存放 2~3 周。

6. 每个管中加 150 μl 冷的 3 mol/L 乙酸钾,pH 5.2,颠倒混合;冰浴 5 分钟,会形成白色絮状沉淀。

3 mol/L 乙酸钾:

5 moI/L 乙酸钾          60 ml

冰乙酸                      11.5 ml

加水到 100 ml。贮存在 4℃。

7. 在小离心机上离心 5 分钟,然后转移 400 μl 上清到一个已作标记的管中。

8. 管中加 0.5 ml 酸/氯仿/异戊醇(50:49:1) 溶液,振摇,在离心机上离心 5 分钟。

酚/氯仿/异戊醇(50:49:1)

50% TE 饱和酚

49% 氯仿

1% 异戊醇

避光贮存于 4℃。

9. 小心地把水相(上层)转移到已作标记的管中。

10. 加 1.0 ml 100% 乙醇,混合,然后离心 5 分钟沉淀 DNA。

11. 去掉上清。应该能看到一个小的白色沉淀物。加 1.0 mI 70% 乙醇洗涤沉淀物,并离心 5 分钟。

12. 去掉上清。管子离心 5 秒钟使残余液体流到管底。吸掉液体,让乙醇挥发 5~10 分钟。(或者可以真空干燥管子。)

13. 用 25~50 μl 的 TE(pH 8.0)重悬沉淀物。质粒 DNA 应该很容易溶解。不易溶解的物质很可能不是 DNA。

14. 在这 32 μI DNA 溶液中加 8.0 μl 4 mol/L NaCl 和 40 μl 113% (w/v) PEG8000。混合均匀并冰浴 1 小时或更长时间。

15. 用小离心机在 4℃ 离心 15 分钟以沉淀 DNA。

16. 小心去掉上清并加 1.0 ml 70% 乙醇洗涤沉淀物,离心 5 分钟。

17. 小心去掉乙醇,离心 5 秒钟使残余液体流到管底。吸掉液体并让乙醇挥发 5~10 分钟。

18. 根据测序方法的要求用 20~30 μl TE 或水重悬沉淀物。
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  • huzm12

    huzm12

    3个月前 觉得难

    很有用,值得收藏一下!

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