细菌细胞的制备实验实验

试剂
- 🔥研选正品-丁香通研选 >
生化试剂

化学试剂生物化学检验试剂

蛋白质类

蛋白质/抗原/多肽蛋白检测蛋白分析蛋白纯化蛋白修饰标准品/对照品酶

核酸类

核酸/蛋白合成核酸分析核酸检测核酸纯化

DNA/RNA

cDNA及合成纯化 RNAi技术 PCR/RT-PCR

分子类

文库及构建克隆与表达表达分析细胞生物学检测免疫检测

药物/生物类

药物筛选动物/植物微生物

饲料类

造模饲料
抗体
- 🔥研选正品-丁香通研选 >
一抗

一抗

WB二抗

western blot二抗

免疫组化抗体

免疫组化二抗

磷酸化抗体

磷酸化特异抗体激酶和磷酸化抗体

亚型对照抗体

裂解液对照组织对照

其他抗体

蛋白A，G PLUS 肿瘤抑制/凋亡抗体信号分子抗体结构蛋白抗体

试剂盒

western 免疫组化试剂盒放射免疫试剂盒流式细胞试剂盒
细胞库/细胞培养
- 🔥研选正品-丁香通研选 >
细胞库

普通细胞原代细胞 ATCC细胞干细胞细胞株

细胞培养

细胞扩增血清血清替代物细胞培养基细胞培养添加物培养基/琼脂混合物细胞因子、趋化因子和生长因子琼脂胰酶中和液蛋白胨多聚赖氨酸氨基酸混合物盐溶液细胞分散试剂消泡剂

细胞检测

细菌检测支原体检测支原体消除细胞繁殖检测导向毒素
ELISA试剂盒
- 🔥研选正品-丁香通研选 >
动物ELISA试剂盒

人ELISA试剂盒小鼠ELISA试剂盒大鼠ELISA试剂盒兔ELISA试剂盒猪ELISA试剂盒

细胞ELISA试剂盒

细胞因子细胞调亡

疾病检测ELISA试剂盒

心肌梗塞检测内分泌检测血栓与止血肝纤维化检测自身免疫检测优生优育检测传染病检测

其它

肿瘤标志物检测激素骨代谢特种蛋白检测活性多肽其它
技术服务
分子生物学

DNA测序 DNA提取/纯化 RT-PCR服务 RNAi全套服务分子生物学载体构建

细胞生物学

细胞培养流式细胞检测细胞毒性测试细胞生物学干细胞服务

蛋白质相关

蛋白质组综合服务蛋白制备质谱服务蛋白质相关 NMR分析

免疫学

抗体制备抗体纯化抗体标记免疫组化/免疫沉淀/Western 免疫学

生物信息学

生物信息学服务生物信息学其他

生物芯片

生物芯片制备蛋白芯片服务组织芯片服务生物芯片

微生物学

微生物鉴定抑菌作用测试内毒素测试微生物学发酵服务

病理学

病理学服务组织学服务病理学

动物实验

转基因动物定制动物进出口基因敲除动物实验

实验整体外包

CRO综合服务实验室定制服务实验整体外包
耗材
- 🔥研选正品-丁香通研选 >
常用耗材

吸头瓶管微孔板过滤培养

PCR耗材

PCR管 PCR条板 PCR板实时定量PCR毛细管

分子类

分子生物学膜

色谱相关

色谱柱色谱介质色谱配件/耗材光谱配件/耗材

实验类

仪器配套常用耗材生物芯片

个人防护

手套口罩实验室用服鞋帽
书籍/软件
软件

序列分析流式分析结构分析图象分析实验分析生物芯片凝胶分析实验室信息化管理仪器设备统计医学科研文本分析医用软件网站建设及服务器临床基础内科学外科学

书籍

临床医学基础医学药学书籍生物医学医学外语医学考试原版书其它

生物医学

普通生物学细胞生物学遗传学生理学生物化学生物物理学分子生物学生物工程学微生物学

基础医学

医用一般科学人体形态学人体生理学病理学医学免疫学医学遗传学心理学
实验室仪器/设备
- 🔥研选正品-丁香通研选 >
分析类仪器

色谱质谱光谱同位素分析测读系统物理特性测定

显微镜

影像系统显微镜

实验室常规

常用设备移液器低温制冷清洗消毒天平核酸提取纯化

实验设备

基因蛋白组环境检测生物芯片细胞分析生化/细胞培养组织学设备电化学分子生物学动物实验仪器神经生物学

医药设备

制药设备药物检测

临床检验设备

免疫分析系统尿液分析系统血气分析系统血液分析系统生化分析系统临床检验设备
论文服务
- 🔥研选正品-丁香通研选 >
写作润色

专业翻译论文写作论文润色

课题研究

课题设计课题申报标书咨询

文章投稿

论文投稿期刊选定其他
原辅料包材
- 🔥研选正品-丁香通研选 >
原料药

呼吸系统类消化系统类循环系统类血液系统类神经系统类解热镇痛类

辅料

崩解剂润滑剂赋形剂增塑剂

中间体

酸类羧酸羧酸盐醇类酮类醛类

包材

输液包材药用瓶药用胶塞肠溶材料包衣材料
医疗器械
- 🔥研选正品-丁香通研选 >
外科手术器械

基础外科手术器械显微外科手术器械神经外科手术器械眼耳鼻喉科手术器械胸腔心血管外科手术器械腹部盆腔外科手术器械矫形外科手术器械妇产科及计划生育手术器械烧伤整形手术器械口腔科手术器械及设备材料

基本设备

普通诊察器械手术室、急救室、诊疗室设备及器具医用卫生材料及敷料消毒和灭菌设备及器具

检验设备

医用电子仪器设备医用光学器具仪器及内窥镜医用超声激光仪器设备医用高频及物理治疗仪器设备中医器械临床检验分析仪器医用化验和基础设备器具体外循环及血液处理设备医用影像放射设备

其他

植入材料和人工器官病房护理设备及器具输液和穿刺设备其他设备
体外诊断
- 🔥研选正品-丁香通研选 >
生化诊断

生化诊断

免疫诊断

放射免疫酶联免疫胶体金荧光免疫化学发光免疫印迹免疫诊断

分子诊断

PCR 原位杂交基因芯片基因测序分子诊断

微生物诊断

药敏试验培养与形态观察全自动微生物分解系统微生物诊断

血液诊断

涂片镜检血细胞分析流式细胞术

POCT

血糖监测类心血管类炎症类凝血类妊娠类 POCT

基因检测

基因检测

ICL-第三方医学检验

ICL-第三方医学检验

其他

临床生化检验试剂其他试剂

首页实验方法细菌细胞的制备实验实验

标签：细菌细胞制备细胞实验指南第3章第5节

本实验来源「细胞实验指南」黄培堂等译。

0 收藏 0 阅读

难度系数

共 0 人打分

点评实验，有机会获丁当奖励

细胞抽提物的制备
核糖体及多核糖体的分离
70S核糖体的纯化
多核糖体的纯化
将核糖体解离为大亚基和小亚基

实验材料	细胞
试剂、试剂盒	弗氏破碎缓冲液匀浆缓冲液
仪器、耗材	弗氏破碎器
实验步骤	1. 将 5~10 g 新鲜或冻存的细胞沉淀物垂悬于弗氏破碎缓冲液中或者适当的匀浆缓冲液中。通常 4L 的大肠杆菌培养物可以获得大约 7.5 g 的细胞沉淀。 2. 悬液中加入无 RNase 的 DNase 至终浓度为 2 μg/ml 并在 4℃ 中放置 20 分钟。 3. 细胞破碎： (1) 真细菌的 70S 核糖体弗氏破碎缓冲液： 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 50 mmol/L MgOAc 100 mmol/L NH₄Cl 1.0 mmol/L DTT 0.5 mmol/L EDTA 细胞在弗氏破碎器中以每平方英寸 16000 磅的压力破碎 1 分钟。 (2) 真细菌多核糖体弗氏破碎缓冲液： 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6 50 mmol/L MgCl₂ 150 mmol/L NH₄CI 细胞在弗氏破碎器中以每平方英寸 13800 磅的压力破碎 1 分钟。 (3) 哺乳动物核糖体将组织切碎并重悬于两倍体积的匀浆缓冲液： ① 哺乳动物匀浆缓冲液： 50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 5 mmol/L MgCl₂ 25 mmol/L KCl 0. 2 mol/L 蔗糖将悬液在玻璃匀浆器中用一只马达驱动的宽松配置的聚四氟乙烯研杵捣 8~10 下，使之匀浆化。如果核糖体来自网织红细胞，则重悬于 2 倍体积的网织红细胞匀浆缓冲液。 ② 网织红细抱匀浆缓冲液： 10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 1.5 mmol/L MgCl₂ 10 mmol/L KCl 2 mmol/L DTT 用玻璃匀浆器和手持的宽松配置的聚四氟乙稀研杆捣 3 次使悬液匀浆化。 (4) 植物核糖体和多核糖体将植物组织用 0.1% 的 DEPC 处理过的 H₂O 于室温下清洗。将组织在液氮中冷冻后用冷的研钵和研杵捣碎成细的粉末。将粉末重悬于 2 倍体积冷的植物抽提缓冲液中：植物抽提缓冲液 50 mmol/L Tris-HCl，pH 9.0 30 mmol/L MgCl₂ 400 mmol/L KCl 17% 蔗糖将悬液在一个磨碎器中每隔 1 分钟施加一次 15 秒的脉冲，重复 4 次使之匀浆化将匀浆液先用 2 层 DEPC 处埋过的冷的纱布（Fisher) 过滤，然后再用 8 层纱布过滤。 (5) 叶绿体核糖体用 dH₂O 清洗植物组织（菠菜叶，250 g），然后悬于 250 ml 的叶绿体匀浆缓冲液中：叶绿体匀浆缓冲液： 100 mmol/L Tris-HCI，pH 7.5 5 mmol/L MgOAc 50 mmol/L KCl 5 mmol/L β-巯基乙醇 0.7 mol/L 蔗糖将悬液在磨碎器中匀浆处理 45 秒，然后用冷的 DEPC 处理过的纱布过滤。于 2℃ 以 360 g 离心 5 分钟使抽提物澄清，然后以 1200 g 离心 15 分钟使叶绿体沉淀下来。用叶绿体匀浆缓冲液洗沉淀物然后再离心沉淀。为了破碎膜并裂解叶绿体，将叶绿体沉淀重悬于含有脱氧胆酸钠（终浓度为 0.5% ) 或 Triton X-100 ( 终浓度为 1.0% ) 的 50 ml 裂解缓冲液中。叶绿体裂解缓冲液： 100 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 10 mmol/L MgOAc 50 mmol/L NH₄CI 6 mmol/L β-巯基乙醇 4. 用 Sorvall SS-34 转头于 4℃ 离心除去裂解物中的细胞碎片，离心速度和时间如下： (1) 对于原核 70S 核糖体，以 30000 g 离心 30 分钟。 (2) 对于真核多核糖体，以 7700 g 离心 8 分钟，保留上清，用于作多核糖体的纯化步骤。 (3) 对于哺乳动物核糖体，以 20000 g 离心 10 分钟。 (4) 对于植物核糖体和多核糖体，以 1000 g 离心 7 分钟，向上清中加入 0.1 体积的 20% Triton X-100 然后以 16000 g 离心 20 分钟。 (5) 对于植物叶绿体，以 26000 g 离心 20 分钟。

实验材料	细胞
试剂、试剂盒	蔗糖溶液高盐蔗糖铺垫液蔗糖铺垫缓冲液重悬缓冲液
实验步骤	1. 为从剩余的细胞组分中分离核糖体，将不含细胞碎片的粗制裂解液以 1：1 的比例铺到 1.1 mol/L 的蔗糖溶液之上。于 4℃ 在Beckinan 50.2 Ti 恒定角度转头中离心，这一过程包括长时间的离心以使 70S 核糖体沉降，同时分离 30S 和 50S 核糖体亚基；较低的离心速度用于初步将 70S 核糖体沉淀出来，而 50S 或 30S 亚基则不沉淀。 (1) 真细菌核糖体高盐蔗糖铺垫液： 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 50 mmol/L MgOAc 100 mmol/L NH4Cl 1 mmol/L DTT 0.5 mmol/L EDTA 1.1 mmol/L 蔗糖以 100000 g 离心 16 小时来沉降 70S 核糖体，可以更换蔗糖铺垫液 2 至 3 次直到获得干净的沉淀物。对于产甲烷菌（mefftancgem)，盐杆菌及硫代谢嗜热菌（eocytes， sulfur-metabolizing )，至少应用高盐溶液洗两次以确保将非核糖体沉淀去除掉。 (2) 哺乳动物核糖体蔗糖铺垫缓冲液： 50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 5 mmol/L MgCl2 25 mmol/L KCl 2 mmol/L 蔗糖以 100000 g 离心 24 小时，沉淀中含有多核糖体，可贮存于 -80℃ 中。 (3) 植物核糖体和多核糖体蔗糖铺垫缓冲液： 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6 5 mmol/L MgCl₂ 50 mmol/L ~ 200 mmol/L NH₄CI 60% 蔗糖以 150000 g 离心 3 小时。用重悬缓冲液洗沉淀物，然后悬于 200 μl 重悬缓冲液中。重悬缓冲液： 50 mmol/L KCl 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6 5 mmol/L MgCl₂ 对多核糖体的进一步纯化可转至多核糖体的纯化步骤。 (4) 叶绿体核糖体高盐蔗糖铺垫缓冲液 10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 10 mmol/L MgOAc 150 mmol/L KCl 6 mmol/L β-巯基乙醇 1 mol/L 蔗糖以 55000 g 离心 12 小时。为除去蔗糖，用不含蔗糖的上述缓冲液漂洗并将沉淀重悬，然后于 4℃ 以 10000 g 离心 10 分钟使悬液澄清。将含有核糖体的沉淀贮存于 -80℃ 或继续进行下面的分离步骤。 2. 到这一阶段，含有核糖体的沉淀已经可以直接使用贮存于 -80℃ 或进一步纯化。

实验材料	核糖体
试剂、试剂盒	致密偶联缓冲液
仪器、耗材	Beckman Vti50 转头
实验步骤	1. 采用 Beckman Vti50 转头和 7% 至 30% (w/v) 的线性蔗糖梯度沉降来纯化 70S 真细菌的核糖体。这一步可以确保大的蛋白质聚集物不会与 70S 核糖体一起沉淀下来。并可以产生致密偶联的 70S 核糖体。 2. 将沉淀重悬在一个小体积的致密偶联的缓冲液，测量样品在 OD₂₆₀ 的吸收并将样品稀释至 100~150 OD₂₆₀ 单位/ml。致密偶联缓冲液： 10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 6 mmol/L MgOAc 50 mmol/L NH₄Cl 1 mmol/L DTT 0.5 mmol/L EDTA 3. 用致密偶联缓冲液制备 7% 和 30% (W/W) 的蔗糖缓冲液，将蔗糖溶液用 Millpore 滤膜过滤（HA 0.45 μm，Milbpore Filter)。 4. 线性蔗糖梯度是在为 Beckman 超速离心机的 Vti50 转头准备的 39 ml 管中制备的。首先自下而上地向管底倒入 18.5 ml 7% 的蔗糖溶液。然后倒入 18.5 ml 30% 的蔗糖溶液，这样使高密度的蔗糖将低密度的蔗糖“托起“。在 4℃ 放罝 2~16 小时使密度梯度形成。 5. 将样品于 42℃ 保温 5 分钟使之热激活，向每一密度梯度（假设为 39 ml 的梯度）上加载 200 OD₂₆₀ 单位的粗制裂解物。 6. 用 Beckman Vti 50 转头以 85000 g 离心 100 分钟。 7. 于冷室中将梯度进行分部收集。每一分部用 ISCO 密度梯度分部收集器收集 15~30 滴。直接于 300 nm 测定各分部的 UV 吸收，或作 100 倍稀释后测定 260 nm 处的 UV 吸收。确定梯度的 A₂₆₀ 曲线并定位 70S 核糖体峰及每个已解离亚基的峰。 8. 用 Beckman 50.2 Ti 转头于 4℃ 以 100000 g 离心 16 小时，分別将含有 70S 核糖体的吸收峰分部及已解离的 30S 和 50S 亚基沉降开来。 9. 沉淀可以保存在 -80℃。

实验材料	真细菌多核糖体植物多核糖体
试剂、试剂盒	多核糖体蔗糖梯度缓冲液蔗糖梯度缓冲液
实验步骤	一、真细菌多核糖体 1. 含有多核糖体（每管 0.6 ml ) 的上清铺到 15%~30% 蔗糖梯度的上面，在该蔗糖梯度的下面为 0.5 ml 的 60% 蔗糖铺垫液，内含如下缓冲液：多核糖体蔗糖梯度缓冲液： 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6 5 mmol/L MgCl₂ 150 mmol/L NH₄CI 2. 用 Berkman SW 50.1 转头，以 245000 g 离心 130 分钟来沉淀多核糖体。 3. 倒掉上清并用 5 ml 冷的蔗糖梯度缓冲液漂洗以除去残余的蔗糖，将多核糖体重悬于 400 μl 相同的缓冲液中。将多核糖体贮存于 -80℃。二、植物多核糖体 1. 将重悬的多核糖体铺在 15%~30% 的蔗糖梯度之上，梯度的底层为 0.5 ml 60% 的蔗糖铺垫液。用如下的缓冲液制备蔗糖梯度：蔗糖梯度缓冲液： 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 5 mmol/L MgCl₂ 0.2 mol/L KCl 2. 用 Beckman SW 50.1 转头，以 150000 g 离心 2 小时将多核糖体沉降下来。 3. 倒掉上清并用 5 ml 冷的蔗糖梯度缓冲液漂洗以除去残余的蔗糖，并将多核糖体重悬于相同的缓冲液中。将多核糖体贮存于 -80℃。

实验材料	核糖体
试剂、试剂盒	解离缓冲液贮存缓冲液
实验步骤	1. 通过将核糖体样品对解离缓冲液透析并用 7%~30% 的线性蔗糖梯度离心来将真细菌 70S 核糖体分离为 30S 和 50S 亚基。解离缓冲液： 10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 1 mmol/L MgOAc 100 mmol/L NH₄Cl 1 mmol/L DTT 0.5 mmol/L EDTA 2. 测量样品在 A₂₆₀ 下的光吸收，将样品用解离缓冲液稀释至每毫升 100~150 A₂₆₀。 3. 将样品于 4℃ 对解离缓和液透析 5 分钟。 4. 用解离缓冲液制备 7% 和 30% 的蔗糖溶液。用 Millipore 过滤蔗糖溶液。 5. 线性蔗糖梯度可以按前述方法在 Beckman Vti 50 转头配套的管中制备。制备 37 ml 梯度和 2 ml 样品。在梯度的制备中，应自下而上地先向管底倒入 18.5 ml 7% 蔗糖溶液，然后倒入 18.5 ml 30% 的蔗糖溶液，从而使浓度渐高的蔗糖将低密度的蔗糖托起。于 4℃ 放置 2~16 小时使梯度形成。 6. 于 42℃ 保温 5 分钟使样品热激活，然后向每个梯度中加载 150~200 A₂₆₀ 单位的样品。 7. 将梯度于 4℃ 以 50000 r/min ( 242000 g ) 离心 70 分钟。 8. 对梯度进行分部收集（每 30 滴为一个分部），确定 A₂₆₀ 曲线，分别倒出单个亚基峰的收集液，用 Beckman 50.2 Ti 转头以 30000 r/min 离心 16 小时来沉淀亚基。 9. 为确保每一亚基样品中含有的其他亚基或其他蛋白质的污染少于 0.5%，可以将亚基作两次梯度离心。 10. 将亚基沉淀物存于 -80℃ 中长期贮存。为便于使用，将沉淀重悬于少量体积的贮存缓冲液中并贮存于 -80℃。贮存缓冲液： 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 10 mmol/L MgOAc 100 mmol/L NH₄CI 1 mmol/L DTT 0.5 mmol/L EDTA 60% 甘油 11. 用 1.5 % 的琼脂糖凝胶电泳确定亚基的纯度。从每一份样品中取一份与等体积的 RNA 凝胶上样缓冲液混合，缓冲液为 0.5% 的 SDS，40% 蔗糖的水溶液。 (1) 哺乳动物核糖体 ① 将多核糖体沉淀重悬于哺乳动物解离缓冲液中，于 4℃ 保温 15 分钟。哺乳动物解离缓冲液： 50 mmol/L 盐酸三乙醇胺，pH 7.5 5 mmol/L MgCl₂ 500 mmol/L KCI 1 mmol/L 嘌呤霉素 ② 保温后，加入 MgCl₂ 至终浓度为 50 mmol/L。将样品用 Beckman Ti 60 转头于 4℃ 以 305000 g 离心 5 小时。将沉淀重悬于不含嘌吟霉素的解离缓冲液中。 ③ 用不含嘌呤霉素的解离缓冲液制备 10% 和 40% (w/w) 的蔗糖溶液。如同真细菌核糖体亚基解离方法中描述的一样，将 0.5 ml 等份铺于 12 ml 的 10%~40% 线性蔗糖梯度之上。 ④ 将梯度用 Beckman SW41 转头于 4℃ 以 190000 g 离心 5 小时。后续步骤同真细菌核糖体分离方法中的一样。 (2) 叶绿体核糖体 ① 将核糖体沉淀重悬于叶绿体解离缓冲液中：叶绿体解离缓冲液： 10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 50 mmol/L NH₄CI 0.1 mmol/L MgOAc 6 mmol/L β-巯基乙醇 ② 用以上缓冲液制备 7%~30% 的线性蔗糖梯度。按照真细菌核糖体亚基解离步骤中的方法制备梯度。 ③ 将样品铺于梯度之上，然后用 Beckman VTi 50 转头于 4℃ 以 50000 r/min ( 242000 g）离心 70 分钟。后续步骤同真细菌核糖体分离方法中的一样。