细菌细胞的制备实验实验

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标签：细菌细胞制备细胞实验指南第3章第5节

本实验来源「细胞实验指南」黄培堂等译。

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细胞抽提物的制备
核糖体及多核糖体的分离
70S核糖体的纯化
多核糖体的纯化
将核糖体解离为大亚基和小亚基

实验材料	细胞
试剂、试剂盒	弗氏破碎缓冲液匀浆缓冲液
仪器、耗材	弗氏破碎器
实验步骤	1. 将 5~10 g 新鲜或冻存的细胞沉淀物垂悬于弗氏破碎缓冲液中或者适当的匀浆缓冲液中。通常 4L 的大肠杆菌培养物可以获得大约 7.5 g 的细胞沉淀。 2. 悬液中加入无 RNase 的 DNase 至终浓度为 2 μg/ml 并在 4℃ 中放置 20 分钟。 3. 细胞破碎： (1) 真细菌的 70S 核糖体弗氏破碎缓冲液： 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 50 mmol/L MgOAc 100 mmol/L NH₄Cl 1.0 mmol/L DTT 0.5 mmol/L EDTA 细胞在弗氏破碎器中以每平方英寸 16000 磅的压力破碎 1 分钟。 (2) 真细菌多核糖体弗氏破碎缓冲液： 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6 50 mmol/L MgCl₂ 150 mmol/L NH₄CI 细胞在弗氏破碎器中以每平方英寸 13800 磅的压力破碎 1 分钟。 (3) 哺乳动物核糖体将组织切碎并重悬于两倍体积的匀浆缓冲液： ① 哺乳动物匀浆缓冲液： 50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 5 mmol/L MgCl₂ 25 mmol/L KCl 0. 2 mol/L 蔗糖将悬液在玻璃匀浆器中用一只马达驱动的宽松配置的聚四氟乙烯研杵捣 8~10 下，使之匀浆化。如果核糖体来自网织红细胞，则重悬于 2 倍体积的网织红细胞匀浆缓冲液。 ② 网织红细抱匀浆缓冲液： 10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 1.5 mmol/L MgCl₂ 10 mmol/L KCl 2 mmol/L DTT 用玻璃匀浆器和手持的宽松配置的聚四氟乙稀研杆捣 3 次使悬液匀浆化。 (4) 植物核糖体和多核糖体将植物组织用 0.1% 的 DEPC 处理过的 H₂O 于室温下清洗。将组织在液氮中冷冻后用冷的研钵和研杵捣碎成细的粉末。将粉末重悬于 2 倍体积冷的植物抽提缓冲液中：植物抽提缓冲液 50 mmol/L Tris-HCl，pH 9.0 30 mmol/L MgCl₂ 400 mmol/L KCl 17% 蔗糖将悬液在一个磨碎器中每隔 1 分钟施加一次 15 秒的脉冲，重复 4 次使之匀浆化将匀浆液先用 2 层 DEPC 处埋过的冷的纱布（Fisher) 过滤，然后再用 8 层纱布过滤。 (5) 叶绿体核糖体用 dH₂O 清洗植物组织（菠菜叶，250 g），然后悬于 250 ml 的叶绿体匀浆缓冲液中：叶绿体匀浆缓冲液： 100 mmol/L Tris-HCI，pH 7.5 5 mmol/L MgOAc 50 mmol/L KCl 5 mmol/L β-巯基乙醇 0.7 mol/L 蔗糖将悬液在磨碎器中匀浆处理 45 秒，然后用冷的 DEPC 处理过的纱布过滤。于 2℃ 以 360 g 离心 5 分钟使抽提物澄清，然后以 1200 g 离心 15 分钟使叶绿体沉淀下来。用叶绿体匀浆缓冲液洗沉淀物然后再离心沉淀。为了破碎膜并裂解叶绿体，将叶绿体沉淀重悬于含有脱氧胆酸钠（终浓度为 0.5% ) 或 Triton X-100 ( 终浓度为 1.0% ) 的 50 ml 裂解缓冲液中。叶绿体裂解缓冲液： 100 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 10 mmol/L MgOAc 50 mmol/L NH₄CI 6 mmol/L β-巯基乙醇 4. 用 Sorvall SS-34 转头于 4℃ 离心除去裂解物中的细胞碎片，离心速度和时间如下： (1) 对于原核 70S 核糖体，以 30000 g 离心 30 分钟。 (2) 对于真核多核糖体，以 7700 g 离心 8 分钟，保留上清，用于作多核糖体的纯化步骤。 (3) 对于哺乳动物核糖体，以 20000 g 离心 10 分钟。 (4) 对于植物核糖体和多核糖体，以 1000 g 离心 7 分钟，向上清中加入 0.1 体积的 20% Triton X-100 然后以 16000 g 离心 20 分钟。 (5) 对于植物叶绿体，以 26000 g 离心 20 分钟。

实验材料	细胞
试剂、试剂盒	蔗糖溶液高盐蔗糖铺垫液蔗糖铺垫缓冲液重悬缓冲液
实验步骤	1. 为从剩余的细胞组分中分离核糖体，将不含细胞碎片的粗制裂解液以 1：1 的比例铺到 1.1 mol/L 的蔗糖溶液之上。于 4℃ 在Beckinan 50.2 Ti 恒定角度转头中离心，这一过程包括长时间的离心以使 70S 核糖体沉降，同时分离 30S 和 50S 核糖体亚基；较低的离心速度用于初步将 70S 核糖体沉淀出来，而 50S 或 30S 亚基则不沉淀。 (1) 真细菌核糖体高盐蔗糖铺垫液： 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 50 mmol/L MgOAc 100 mmol/L NH4Cl 1 mmol/L DTT 0.5 mmol/L EDTA 1.1 mmol/L 蔗糖以 100000 g 离心 16 小时来沉降 70S 核糖体，可以更换蔗糖铺垫液 2 至 3 次直到获得干净的沉淀物。对于产甲烷菌（mefftancgem)，盐杆菌及硫代谢嗜热菌（eocytes， sulfur-metabolizing )，至少应用高盐溶液洗两次以确保将非核糖体沉淀去除掉。 (2) 哺乳动物核糖体蔗糖铺垫缓冲液： 50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 5 mmol/L MgCl2 25 mmol/L KCl 2 mmol/L 蔗糖以 100000 g 离心 24 小时，沉淀中含有多核糖体，可贮存于 -80℃ 中。 (3) 植物核糖体和多核糖体蔗糖铺垫缓冲液： 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6 5 mmol/L MgCl₂ 50 mmol/L ~ 200 mmol/L NH₄CI 60% 蔗糖以 150000 g 离心 3 小时。用重悬缓冲液洗沉淀物，然后悬于 200 μl 重悬缓冲液中。重悬缓冲液： 50 mmol/L KCl 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6 5 mmol/L MgCl₂ 对多核糖体的进一步纯化可转至多核糖体的纯化步骤。 (4) 叶绿体核糖体高盐蔗糖铺垫缓冲液 10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 10 mmol/L MgOAc 150 mmol/L KCl 6 mmol/L β-巯基乙醇 1 mol/L 蔗糖以 55000 g 离心 12 小时。为除去蔗糖，用不含蔗糖的上述缓冲液漂洗并将沉淀重悬，然后于 4℃ 以 10000 g 离心 10 分钟使悬液澄清。将含有核糖体的沉淀贮存于 -80℃ 或继续进行下面的分离步骤。 2. 到这一阶段，含有核糖体的沉淀已经可以直接使用贮存于 -80℃ 或进一步纯化。

实验材料	核糖体
试剂、试剂盒	致密偶联缓冲液
仪器、耗材	Beckman Vti50 转头
实验步骤	1. 采用 Beckman Vti50 转头和 7% 至 30% (w/v) 的线性蔗糖梯度沉降来纯化 70S 真细菌的核糖体。这一步可以确保大的蛋白质聚集物不会与 70S 核糖体一起沉淀下来。并可以产生致密偶联的 70S 核糖体。 2. 将沉淀重悬在一个小体积的致密偶联的缓冲液，测量样品在 OD₂₆₀ 的吸收并将样品稀释至 100~150 OD₂₆₀ 单位/ml。致密偶联缓冲液： 10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 6 mmol/L MgOAc 50 mmol/L NH₄Cl 1 mmol/L DTT 0.5 mmol/L EDTA 3. 用致密偶联缓冲液制备 7% 和 30% (W/W) 的蔗糖缓冲液，将蔗糖溶液用 Millpore 滤膜过滤（HA 0.45 μm，Milbpore Filter)。 4. 线性蔗糖梯度是在为 Beckman 超速离心机的 Vti50 转头准备的 39 ml 管中制备的。首先自下而上地向管底倒入 18.5 ml 7% 的蔗糖溶液。然后倒入 18.5 ml 30% 的蔗糖溶液，这样使高密度的蔗糖将低密度的蔗糖“托起“。在 4℃ 放罝 2~16 小时使密度梯度形成。 5. 将样品于 42℃ 保温 5 分钟使之热激活，向每一密度梯度（假设为 39 ml 的梯度）上加载 200 OD₂₆₀ 单位的粗制裂解物。 6. 用 Beckman Vti 50 转头以 85000 g 离心 100 分钟。 7. 于冷室中将梯度进行分部收集。每一分部用 ISCO 密度梯度分部收集器收集 15~30 滴。直接于 300 nm 测定各分部的 UV 吸收，或作 100 倍稀释后测定 260 nm 处的 UV 吸收。确定梯度的 A₂₆₀ 曲线并定位 70S 核糖体峰及每个已解离亚基的峰。 8. 用 Beckman 50.2 Ti 转头于 4℃ 以 100000 g 离心 16 小时，分別将含有 70S 核糖体的吸收峰分部及已解离的 30S 和 50S 亚基沉降开来。 9. 沉淀可以保存在 -80℃。

实验材料	真细菌多核糖体植物多核糖体
试剂、试剂盒	多核糖体蔗糖梯度缓冲液蔗糖梯度缓冲液
实验步骤	一、真细菌多核糖体 1. 含有多核糖体（每管 0.6 ml ) 的上清铺到 15%~30% 蔗糖梯度的上面，在该蔗糖梯度的下面为 0.5 ml 的 60% 蔗糖铺垫液，内含如下缓冲液：多核糖体蔗糖梯度缓冲液： 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6 5 mmol/L MgCl₂ 150 mmol/L NH₄CI 2. 用 Berkman SW 50.1 转头，以 245000 g 离心 130 分钟来沉淀多核糖体。 3. 倒掉上清并用 5 ml 冷的蔗糖梯度缓冲液漂洗以除去残余的蔗糖，将多核糖体重悬于 400 μl 相同的缓冲液中。将多核糖体贮存于 -80℃。二、植物多核糖体 1. 将重悬的多核糖体铺在 15%~30% 的蔗糖梯度之上，梯度的底层为 0.5 ml 60% 的蔗糖铺垫液。用如下的缓冲液制备蔗糖梯度：蔗糖梯度缓冲液： 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 5 mmol/L MgCl₂ 0.2 mol/L KCl 2. 用 Beckman SW 50.1 转头，以 150000 g 离心 2 小时将多核糖体沉降下来。 3. 倒掉上清并用 5 ml 冷的蔗糖梯度缓冲液漂洗以除去残余的蔗糖，并将多核糖体重悬于相同的缓冲液中。将多核糖体贮存于 -80℃。

实验材料	核糖体
试剂、试剂盒	解离缓冲液贮存缓冲液
实验步骤	1. 通过将核糖体样品对解离缓冲液透析并用 7%~30% 的线性蔗糖梯度离心来将真细菌 70S 核糖体分离为 30S 和 50S 亚基。解离缓冲液： 10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 1 mmol/L MgOAc 100 mmol/L NH₄Cl 1 mmol/L DTT 0.5 mmol/L EDTA 2. 测量样品在 A₂₆₀ 下的光吸收，将样品用解离缓冲液稀释至每毫升 100~150 A₂₆₀。 3. 将样品于 4℃ 对解离缓和液透析 5 分钟。 4. 用解离缓冲液制备 7% 和 30% 的蔗糖溶液。用 Millipore 过滤蔗糖溶液。 5. 线性蔗糖梯度可以按前述方法在 Beckman Vti 50 转头配套的管中制备。制备 37 ml 梯度和 2 ml 样品。在梯度的制备中，应自下而上地先向管底倒入 18.5 ml 7% 蔗糖溶液，然后倒入 18.5 ml 30% 的蔗糖溶液，从而使浓度渐高的蔗糖将低密度的蔗糖托起。于 4℃ 放置 2~16 小时使梯度形成。 6. 于 42℃ 保温 5 分钟使样品热激活，然后向每个梯度中加载 150~200 A₂₆₀ 单位的样品。 7. 将梯度于 4℃ 以 50000 r/min ( 242000 g ) 离心 70 分钟。 8. 对梯度进行分部收集（每 30 滴为一个分部），确定 A₂₆₀ 曲线，分别倒出单个亚基峰的收集液，用 Beckman 50.2 Ti 转头以 30000 r/min 离心 16 小时来沉淀亚基。 9. 为确保每一亚基样品中含有的其他亚基或其他蛋白质的污染少于 0.5%，可以将亚基作两次梯度离心。 10. 将亚基沉淀物存于 -80℃ 中长期贮存。为便于使用，将沉淀重悬于少量体积的贮存缓冲液中并贮存于 -80℃。贮存缓冲液： 20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 10 mmol/L MgOAc 100 mmol/L NH₄CI 1 mmol/L DTT 0.5 mmol/L EDTA 60% 甘油 11. 用 1.5 % 的琼脂糖凝胶电泳确定亚基的纯度。从每一份样品中取一份与等体积的 RNA 凝胶上样缓冲液混合，缓冲液为 0.5% 的 SDS，40% 蔗糖的水溶液。 (1) 哺乳动物核糖体 ① 将多核糖体沉淀重悬于哺乳动物解离缓冲液中，于 4℃ 保温 15 分钟。哺乳动物解离缓冲液： 50 mmol/L 盐酸三乙醇胺，pH 7.5 5 mmol/L MgCl₂ 500 mmol/L KCI 1 mmol/L 嘌呤霉素 ② 保温后，加入 MgCl₂ 至终浓度为 50 mmol/L。将样品用 Beckman Ti 60 转头于 4℃ 以 305000 g 离心 5 小时。将沉淀重悬于不含嘌吟霉素的解离缓冲液中。 ③ 用不含嘌呤霉素的解离缓冲液制备 10% 和 40% (w/w) 的蔗糖溶液。如同真细菌核糖体亚基解离方法中描述的一样，将 0.5 ml 等份铺于 12 ml 的 10%~40% 线性蔗糖梯度之上。 ④ 将梯度用 Beckman SW41 转头于 4℃ 以 190000 g 离心 5 小时。后续步骤同真细菌核糖体分离方法中的一样。 (2) 叶绿体核糖体 ① 将核糖体沉淀重悬于叶绿体解离缓冲液中：叶绿体解离缓冲液： 10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 50 mmol/L NH₄CI 0.1 mmol/L MgOAc 6 mmol/L β-巯基乙醇 ② 用以上缓冲液制备 7%~30% 的线性蔗糖梯度。按照真细菌核糖体亚基解离步骤中的方法制备梯度。 ③ 将样品铺于梯度之上，然后用 Beckman VTi 50 转头于 4℃ 以 50000 r/min ( 242000 g）离心 70 分钟。后续步骤同真细菌核糖体分离方法中的一样。