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小鼠胚成纤维细胞的培养和体外分化

标签: 小鼠 胚成纤维细胞 培养 体外分化 细胞实验指南 第1章 第8节

本实验来源「细胞实验指南」 黄培堂 等译。

实验方法
  • 原代MEF的分离和冻存
  • MEF滋养板的制备
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
1. 准备下列试剂和材料:

确定怀孕期的母鼠(孕期14至6天)

无菌解剖器械(镊子、剪刀、手术刀片)

Cellector 带收集装置的不锈钢滤网,1 mm 直径筛网

内有搅拌棒的 125 ml 无菌的胰蛋白酶消化的烧瓶

有搅拌盘的培养箱

无 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS

胰蛋白酶溶液

DNase 溶液(10 mg/ml)

MEF 生长培养基

MEF 冻存培养基

150 mm 和 100 mm 组织培养皿

2 ml 冷冻管

2. 杀死怀孕 14~16 天的母鼠,取出子宫,放在盛有 PBS 的 100 mm 组织培养皿中,取出胚胎,去胚胎外组织,PBS 冲洗去血。

3. 用无菌镊子去胚胎头和内脏。

4. 胚胎转移到盛有 40 ml PBS 的 50 ml 无菌离心管中,轻轻颠倒两次。小心倒掉 PBS,再加 40 ml PBS 清洗。倒掉 PBS,留 10 ml 将胚胎转移到 100 mm 培养皿。

5. 手术刀片细细切碎胚胎,用镊子挤压使其通过无菌滤网。15 ml 胰酶溶液冲洗滤网两次,解剖胚胎混合物转移至 125 ml 胰酶消化的烧瓶。加 400 μl DNase 粗品,以免释放出的 DNA 导致溶液过黏。

6. 湿润的 5% CO2 温箱中 37℃ 轻轻搅动孵育 30 分钟。

7. 由烧瓶侧臂把上层细胞悬液倒入一装有 10 ml MEF 生长培养基的 50 ml 离心管。

8. 离心收集细胞。

9. 30 ml MEF 生长培养基洗两次。

10. 细胞悬于 15 ml 生长培养基,用血细胞计数可存活有核细胞(非血红细胞或碎片)。10 只 15 天幼鼠可获得 5X107 到 1X108 细胞。

11. 6X106 细胞悬于 25 ml MEF 生长培养基,接种一块 150 mm 培养皿(总计接种 10~15 块)。

12. 24 小时后更换新鲜 MEF 生长培养基。

13. 约 2~4 天后细胞长满,1:5 传代。分 8 批操作,15 ml PBS 冲洗,倒掉,加 10 ml 胰酶溶液,37℃ 孵育 5 分钟。

14. 每块胰酶消化的细胞板加 10 ml 生长培养基,轻柔吹吸,分散细胞,转移到 50 ml 离心管,两块板的细胞合并到一管中。

15. 离心收集细胞。细胞悬于培养基中,1:5 分加到 150 mm 培养皿。

16. 约 3 天后细胞长满,可以收获冻存于液氮中。分 8 批操作,15 ml PBS 冲洗,倒掉,加 10 ml 胰酶,37℃ 孵育 5 分钟。

17. 加 10 ml MEF 生长培养基,轻柔吹吸,分散细胞,转移到 50 ml 离心管。

18. 离心收集细胞。每块培养皿收获的细胞悬于 2 ml 冻存培养基。

19. 每支冷冻管加 1 ml 细胞,旋紧盖子,-80℃ 冰箱过夜。此步操作需迅速。

20. 第二天将细胞转移至液氮中。转移过程中需放在干冰上避免升温。



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注意事项
 
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实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
1. 准备下列材料

MEF 生长培养基

胰酶溶液

无 Ca2+ 和 Mg2+ PBS

丝裂霉素 C

明胶溶液(0.1%)

150 mm 组织培养皿

滋养细胞组织培养皿

2. 准备一支 15 ml 离心管,加 5 ml 预热(37℃)MEF 生长培养基。取一支液氮冻存的 MEF 细胞,37℃ 水浴中轻轻振荡,细胞融化后转移到离心管中。

3. 离心收集细胞,悬于 10 ml MEF 生长培养基,接种 150 mm 组织培养皿,加 MEF 生长培养基至 25 ml。37℃ 孵育至细胞长满(约 2~3 天)。

4. 细胞长满后加入丝裂霉素 C。吸掉培养基,加入新配制的含丝裂霉素 C(10 μg/ml)的 MEF 生长培养基。37℃ 孵育 2.5 小时。

5. 孵育同时准备明胶处理的滋养细胞培养皿。

(1) 0.1% 明胶溶液覆盖空的组织培养皿底,室温保温 15 分钟。

(2) 倒掉明胶溶液,培养皿晾干,平放待用。

6. 去掉培养基,10 ml PBS 冲洗三次,完全去除丝裂霉素 C,加 10 ml 胰酶溶液,37℃ 孵育 5 分钟。

7. 加 3 ml MEF 生长培养基,吹吸分散细胞,转移至 15 ml 离心管。

8. 离心收集细胞,悬于 10 ml MEF 生长培养基,计数细胞。

9. 丝裂霉素处理的 MEF 细胞以合适密度接种明胶包被培养皿。


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