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质粒DNA提取实验

标签: 质粒 DNA 提取

质粒DNA提取可以:(1)快速纯化质粒;(2)用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。

详细
实验方法
  • 碱解法
  • SDS碱裂解法(试剂盒提取)
实验方法原理

碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性,再将pH值调至中性使其复性,复性的为质粒DNA,而染色体DNA不会复性,缠结成网状物质,通过离心除去。

实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
一、材料与试剂准备


1.  材料:大肠杆菌。


2.  仪器:超净工作台,培养箱,摇床,恒温水浴锅,台式离心机,取液器一套,低温冰箱,冷冻真空干燥机,电泳仪,水平电泳槽,紫外观测仪。


3.  试剂:


(1)Solution I :25 mM Tris-Hcl(pH7.4),10 mM EDTA(pH8.0),50 mM葡萄糖,高压灭菌,4℃保存。


(2)Solution II :0.2 M NaOH, 1%SDS 现配现用。


(3)Solution III :5 N KAc pH4.8,高压灭菌,4℃保存。


(4)3 M NaAc pH5.2,高压灭菌,4℃保存。


(5)异丙醇,溶菌酶(8 mg/ml),酚/氯仿,无水乙醇,70%乙醇,LB培养基,电泳试剂。


二、操作步骤


1.  细菌繁殖:LB培养基,2 ml/20 ml,37℃,200 rpm,摇一摇,过夜。


2.  离心10 min,5 000 rpm, 4℃;弃上淸液。


3.  沉淀(菌体细胞)预冷的TES缓冲液洗涤,离心10 min,5 000 rpm, 4℃,加入预冷的1 ml Solution I,冰浴10 min。


4.  重新悬浮,加入150 ul溶菌酶母液,室温放置5 min。


5.  加入1.2 ml Solution II, 冰浴5 min。


6.  加入0.9 ml预冷乙酸钾,混匀,离心10 min,12 000 rpm,4℃。


7.  加入1.5 ml异丙醇,-20℃冰箱内放置15 min。


8.  离心10 min,12 000 rpm,4℃。


9.  取沉淀,悬于400 ul TE缓冲液中。


10.  加入40 ul,3 M NaAc。


11.  酚/氯仿,抽提,乙醇沉淀。


12.  离心10 min,12 000 rpm,4℃。


13.  取沉淀,冷冻干燥,再悬浮于50 ul TE缓冲液中。


14.  电泳检测提取DNA的质量。

展开 
实验方法原理
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法,碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离,当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时,变性的质粒DNA又恢复原来的构型,保存在溶液中,而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
 
简明原理:碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性,再将pH值调至中性使其复性,复性的为质粒DNA,而染色体DNA不会复性,缠结成网状物质,通过离心除去。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
一、试剂盒组成、贮存、稳定性
 
耗材:DNA 制备管,2 ml 离心管,1.5 ml 离心管。
 
RNase A:50 mg/ml,室温保存。
 
Buffer S1:细菌悬浮液。加入RNase A 后,4°C 贮存。
 
Buffer S2: 细菌裂解液,室温密闭贮存。(若出现沉淀,应于37°C 温浴溶解并冷却至室温后再使用。)
 
Buffer S3:中和液,室温密闭贮存。
 
Buffer W1:洗涤液,室温密闭贮存。
 
Buffer W2 concentrate:去盐液。使用前,根据瓶上数量加入乙醇,混合均匀,室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。
 
Eluent:2.5 mM Tris-HCl,pH 8.5,室温密闭贮存。
 
二、实验准备
 
1.  第一次使用前,RNase A全部加入Buffer S1 中,4°C贮存。
 
2.  准备无核酸和核酸酶污染的Tip头、离心管。
 
3.  第一次使用前,Buffer W2 concentrate中加入指定体积的无水乙醇。
 
三、操作步骤
 
1.  取1-4 ml 在LB 培养基中培养过夜的菌液(若使用丰富培养基,菌液体积应减半或更少),12 000×g 离心1 min,弃尽上清。
 
2.  用250 μl 已加入RNase A 的Buffer S1 悬浮细菌沉淀,悬浮需均匀,不应留有小的菌块。
 
3.  加入250 μl Buffer S2,温和并充分地上下翻转混合4-6 次均匀使菌体充分裂解,直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5 min。
 
4.  加入350 μl Buffer S3,温和并充分地上下翻转混合6-8 次,12 000×g 离心10 min。
 
步骤5~7 可以选择负压法或离心法纯化质粒DNA。
 
A.  负压法
5A.  将质粒DNA 制备管插到负压装置的接口上。吸取步骤4 中的离心上清并转移到制备管中,开启并调节负压至-20-30 英寸汞柱,缓慢吸走管中溶液。
 
6A.  加500 μl Buffer W1,吸尽管中溶液。
 
7A.  加700 μl Buffer W2,吸尽管中溶液;以同样的方法再用700 μl Buffer W2 洗涤一次。
 
* 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
 
B. 离心法
 
5B.  吸取步骤4 中的离心上清并转移到DNA 制备管(置于2 ml 离心管中),12 000×g 离心1 min。
 
6B.  将制备管置回离心管,加500 μl Buffer W1,12 000×g 离心1 min,弃滤液。
 
7B.  将制备管置回离心管,加700 μl Buffer W2,12 000×g 离心1 min, 弃滤液;以同样的方法再用700 μl Buffer W2 洗涤一次。弃滤液。
 
* 确认在Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。
 
8.  将制备管置回2 ml 离心管中,12 000×g 离心1 min。
 
9.  将制备管移入新的1.5 ml 离心管中,在DNA 制备膜正中央加60-80 μl 水或Eluent,室温静置1 min。12 000×g 离心1 min。
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注意事项
1.  Buffer S2、Buffer S3和Buffer W1含刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套和眼镜,避免沾染皮肤、眼睛和衣服,谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时,要立即用大量清水或生理盐水冲洗,必要时寻求医疗咨询。

2.  本试剂盒为AxyPrep 质粒DNA小量试剂盒,适合于从1-4 ml 细菌培养物中提取多至20 μg 高纯的质粒DNA。
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最新实验心得
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实验问答
(共30个问题)
谁能提供实验帮助?
更多 谁做这个实验?
  • guxien1987

    guxien1987

    3个月前 觉得简单

    新手,难,尤其是配液

  • pengjunjie1993

    pengjunjie1993

    3个月前 觉得一般

    质粒提取总的来说还是不是特别难

  • 易先生

    易先生

    3个月前 觉得一般

    第一次看师姐做,觉得还行,后面自己做的时候再看吧

  • chenjinli236

    chenjinli236

    3个月前 觉得很难

    谢谢分享,简单明了,受用了。

  • Acper

    Acper

    3个月前 觉得很简单

    一般

  • hslmz

    hslmz

    3个月前 觉得一般

    很基础的实验

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12345很简单

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