标准 PCR 技术应用于定位在两个引物之间(指向内部)的一段 DNA 片段的扩增。与此相反,反向 PCR (inverse PCR) 应用于扩增和克隆与已知 DNA 序列某一个末端相邻的侧翼的未知 DNA 序列,这种未知序列没有引物可以利用。该项技术由几个研究小组开发(Ochmanetal. 1988; Triglia et al. 1988; Silver and Keerikatte 1989),包括对含有已知序列以及侧翼区域的基因组 DNA 样品用一种在靶序列中无切点的限制性内切酶消化;酶切片段(如果是总的哺乳动物基因组 DNA,这种酶切片段往往有成千上万种)依靠分子内部连接发生自身环化;然后用这种自身环化的 DNA 作为 PCR 扩增的模板。实验用一对与已知序列的两端特异性结合的引物,通过二个方向向夹在中间的未知序列区域扩增。