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琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中DNA的回收(电洗脱至透析袋)

标签: 琼脂糖 聚丙烯酰胺凝胶 DNA的回收 电洗脱至透析袋 分子克隆实验指南第三版 第5章 方案4

这种技术(McDonell et al. 1977 ) 可以从琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶切片回收分子质量范围较宽的双链 DNA,并且产量较高。这种方法多少有些麻烦,必须将凝胶切片单独放入透析袋,因此不能用于回收多种 DNA 样品。但是电洗脱效果很好可以避免其他方法所遇到的问题。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

实验方法
  • 琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中DNA的回收(电洗脱至透析袋)
实验方法原理 这种技术(McDonell et al. 1977 ) 可以从琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶切片回收分子质量范围较宽的双链 DNA,并且产量较高。这种方法多少有些麻烦,必须将凝胶切片单独放入透析袋,因此不能用于回收多种 DNA 样品。但是电洗脱效果很好可以避免其他方法所遇到的问题。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
一、材料

1. 缓冲液和溶液

乙醇

EB 或 SYBR Gold 染色液

酚:氯仿(1:1 , V/V)

乙酸钠(3 mol/L, pH 5.2)

0.25X TBE 电泳缓冲液

含 0.5 μg/ml 溴化乙锭的 0.25 X TBE 电泳缓冲液

2. 酶和缓冲液

限制性内切核酸酶

3. 凝胶

琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶

4. 核酸和寡核苷酸

DNA 样品

5. 专用设备

煮过的透析袋

透析袋夹

水平电泳槽

手提式长波紫外灯(302 nm)

二、方法

1. 消化可以获得至少 100 ng 的目的 DNA 片段。在适当浓度的琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺中进行电泳分离,用含有 0.5 μg/ml 溴化乙锭或 SYBR Gold 染色。用手提式长波长紫外灯确定所需条带的位置。

2. 用一锋利的手术刀片或剃刀片,切下含有目的条带的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶切片,置于用 0.25X TBE 湿润的方形石蜡膜上。尽可能使切下的琼脂糖体积最小,以减少抑制剂对 DNA 的污染,并缩短 DNA 迁移出凝胶的距离,同时也保证能容易地将其放入透析袋中。

3. 切下条带后,进行照相,以获得洗脱条带的记录。

4. 戴上手套,用透析袋夹将透析袋一端封住。用 0.25X TBE 充满透析袋直至激出,拿住袋颈,轻挤透析袋以打开袋口。用药勺将凝胶切片转移至充满缓冲液的透析袋中。

5. 使凝胶切片沉至袋底。去掉大部分缓冲液,留下足够液体以使凝胶切片始终保持与缓冲液接触。然后就在凝胶切片上方用透析袋夹将袋夹紧,避免存留气泡和夹碎凝胶切片。在透析袋夹上用记号笔标记上 DNA 片段的名字。

6. 把透析袋浸泡在盛有一浅层 0.25X TBE 的水平电泳槽中。用玻璃棒或吸管防止透析袋漂浮,同时使凝胶切片的方向与电极平行。使电流通过透析袋,电压通常为 7.5 V/cm, 持续 45~60 min。用手提式长波紫外灯来监测 DNA 从凝胶切片中迁移出来。

如果电泳时间太短,只有部分的 DNA 从凝胶切片中迁移出来,这样会降低回收率。同样,如果电泳时间太长,则会导致 DNA 附着到透析袋壁上。通常在 0.25X TBE 缓冲液中,电压为 7.5 V/cm, 持续 45~60 min 就可以从凝胶切片将 0.1~2.0 kb 的 DNA 片段洗脱约 85%。



7. 倒转电流的极性电泳 20 s,使 DNA 从管壁上释放下来。切断电源,从电泳槽中取出透析袋,轻揉它以便使 DNA 进入缓冲液。

8. 反向电泳后,打开透析袋夹,小心将凝胶周围的所有缓冲液转移至一个塑料管中。从袋内取出凝胶切片,如步骤 9 介绍的将其染色。用巴斯德吸管吸取少量 0.25X TBE 冲洗透析袋,将洗液加到塑料管中。

9. 将凝胶切片浸入含有溴化乙锭(0.5 μg/ml) 的 0.25X TBE 中,于室温染色 30~45 min。在紫外线下检査凝胶切片,确证全部 DNA 已被洗脱。

10. 通过 DEAE-SepHacel,或用市售树脂层析,或用酚:氯仿抽提和标准的乙醇沉淀纯化 DNA 片段。
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