10. 建立用 Mbo I 部分消化 30 ng 高分子质量基因组 DNA 样品的反应条件,目的是产生最大量的大小为 38~52 kb 的 DNA 片段。
消化反应的进程可通过脉冲电场凝胶电泳 ( PFGE) 或 0.5% 琼脂糖凝胶电泳(效果较差)来鉴定,同时采用以下标记物:① 单位长度的 λ 噬菌体 DNA 和(或)② 连接于 cos 位点的 λ 噬菌体 DNA 多聚体,这些多聚体经仅切割线状 λ DNA 一次的限制酶部分消化。0.5% 的琼脂糖凝胶非常稀薄,灌胶及电泳最好在 4℃ 下进行,并采用低电压(1~2 V/cm) 长时间(15~24 h) 电泳。
当只有少量基因组 DNA 可利用时(如利用流动分选的染色体或凝胶纯化的 YAC DNA 构建文库时),部分消化的条件可建立在小规模的反应体系中,该体系含有 50~100 ng 基因组 DNA 和不同量 ( 0.0005 ~0.001 单位)的限制酶。消化 15 min 后,取 10~20 ng 的小份反应物用脉冲场凝胶电泳(PFGE)和 Southern 印迹来分析,Southern 印迹所用探针与被检测 DNA 有重复序列。
11. 根据步骤 10 中所建立的部分消化条件,建立三个大规模的反应体系,每个含有 100 μg 的高分子质量基因组 DNA 和步骤 10 确定的最佳浓度的 MboI。温育结束后,从每一部分消化的 DNA 中取出小量通过琼脂糖凝胶电泳鉴定分子大小,方法同步骤 10 中注释。
12. 合并经部分消化获得的含有最大量 38 - 52 kb 大小基因组 DNA 片段的两部分样品。 用酚: 氯仿和氯仿分别抽提合并后的 DNA 一次。乙醇沉淀,70% 乙醇洗涤一次。用 180 μl TE (pH 8.0) 溶解湿润的 DNA 沉淀。
高分子质量基因组 DNA 的去磷酸化
13. 向上述重悬的部分消化的基因组 DNA 中加入 20 μl 10 x 去磷酸化缓冲液和 20 单位 CIP。迅速抽取少量 DNA 样品用作对照。
(1) 移取一小份含有 0.1~1.0 μg DNA 反应物至一个小的微量离心管(0.5 ml) 中, 该管中事先加有含 0.3 μg 线状质粒的 1X 去磷酸化缓冲液(如经 Bam HI 切割的 pUC)。
可克隆于黏粒中插入片段的大小受制备包装提取物所采用方法的影响(Bates and Swift 1983)。在理想情况下,用于包装黏粒的提取物应该用含亚精胺而不是腐胺的缓冲液制备。当包装提取物和包装反应中去除腐胺时,该系统显示对被包装的 DNA 分子大小的选择性。因此,当 DNA 长度为野生型体 DNA 80% 时, 其包装效率为野生型 λ 菌体的 1/200。在块乏腐胺的情况下,含有较大插入片段(约 45 kb) 的黏粒被优先包装,由于尚未知晓的原因,也可能是由于缺乏 ter 功能,一些适合于 λ 菌体 DNA 的包装提取物并不适合包装黏粒。一些商品化包装提取物,如 Stratagene 的 Gigapack Ⅲ XL, 比其他提取物更适合于黏粒文库的构建。
20. 转导适宜的大肠杆菌宿主菌,以测定每份包装反应物中包装黏粒的滴度。从每份反应物中取出一小份稀释 100 倍后,取 0.1 ml 与 0.1 ml SM 和 0.1 ml 新鲜平板接种菌混匀。将被感染的培养物在 37℃ 下温育 20 min, 以使含有重组黏粒的噬菌体颗粒吸附。加入 1 ml TB, 37℃ 继续温育 45 min, 使 SuperCos-1 载体中的卡那霉素抗性基因得到表达。
21. 取 0.5 ml 和 0.1 ml 细菌培养物涂布于含 25 μg/ml 卡那霉素的 TB 琼脂平板上。于 37℃ 温育过夜,然后计算细菌菌落数。