3. 用1ml 冰冷的 HSB 缓冲液重悬细胞核沉淀物,然后加入 10ul DNA 酶溶液。上下吹打核酸直到核酸重悬起来并且溶液的黏滞度下降(1~5 min)。加 2 ml 终止缓冲液。 DNA 酶处理可以减低溶液的黏滞度并防止新生的放射标记 RNA 转录物被基因组 DNA 捕获。黏滞度不会完全消除,也经常会留有核酸团块。
4.(可选)为了提高放射标记 RNA 的产量,在 DNA 酶处理以后,可以加入蛋白酶 K。在加入 2 ml 终止缓冲液后,加入蛋白酶 K 使其终浓度为100ug/ml。溶液在 42°C 孵育 30 min。进行步骤 5。 更大规模的 DNA 去除和放射标记 RNA 纯化的方案请参见 Groudine 等 (1981)。
5. 加 3 ml 酚,混合物在 65°C 孵育 15 min, 在此期间每 5 min 进行振摇。加 3 ml 氯仿/异戊醇,振荡,以 1900 g 离心分离有机相和水相(Sorvall Hl000B 转头 3000r/min)。 再次用 3 ml 氯仿抽提水相,如前离心,并把水相转移到新管中。
6. 加 0.3 ml5mol/L LiCl 和 2.5 倍体积的乙醇,混合均勻。以 12000 g (Sorvall SS-34 转头 10000r/min) 离心 10 min 收集核酸沉淀。