引物延伸实验

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一抗

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标签：引物延伸

引物延伸分析用于确定位置和定量特定RNA的5'-端的数量。结束标记的寡核苷酸杂交，RNA和利用中存在的脱氧核苷酸逆转录作为底漆。因此RNA的反转录成cDNA，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。cDNA的长度反映了基地之间的标记引物和RNA的5'-端核苷酸的数量，基因产品的数量是针对性的RNA的量成正比。

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引物延伸实验

实验材料	RNA
试剂、试剂盒	T4多核苷酸激酶 dATP 醋酸钠乙醇 EDTA RNaseA 苯酚氯仿
仪器、耗材	恒温培养箱 NAP-5柱 -70°C冰箱低温离心机
实验步骤	1. 依次加入下列试剂，建立用以标记引物的反应混合液（终体积10 μl）（1）2.5 μl H₂O （2）1 μl 10×T4多核苷酸激酶缓冲液（3）1 μl 0.1 mol/l DTT （4）1 μl 1 mol/l 亚精胺（5）1 μl 50~100 ng/μl 挂核苷酸引物（6）3 μl 10 μCi/μl［γ-³²P］ATP （7）0.5 μl 20~30 U/μl T4多核苷酸激酶（8）37℃温育1 h。 2. 加入2 μl 0.5 mol/l EDTA和50 μl TE缓冲液终止反应，于65℃温育5 min。 3. 用硅化过的1 000 μl 吸头塞上玻璃棉作成一小离子交换拄，加入20 μl AG 50W-X8树脂和100 μl DE-52树脂，以1 ml TEN缓冲液洗柱。 4. 将步骤2的标记反应物加入柱子，收集流出液重复上柱。 5. 用1 ml，TEN100缓冲液洗柱，然后以0.5 ml TEN300洗，弃洗脱液。 6. 以0.4 ml TEN600缓冲液洗脱标记寡核苷酸引物，收集流出液，在有合适屏蔽的容器中保存于-20℃备用。 7. 取RNA样品在微量离心管中将下列物质混合（终体积15 μl）：（1）10 μl 细胞总RNA （2）1.5 μl 10×杂交液（3）3.5 μl 放射性标记寡核苷酸（4）确保微量离心管密封，并将其淹没在65 ℃水洛中90 min，取出在空温中慢慢冷却。 8. 在冰浴的微量离心管中加入以下延伸反应混合液（终体积每个RNA样品30.33 μl）：（1）0.9 μl 1mol/l Tris·Cl缓冲液，pH8.3 （2）0.9 μl 0.5 mol/l MgCl₂ （3）0.25 μl 1 mol/l DTT （4）6.75 μl 1 mg/ml 放线菌素D （5）1.33 μl 5 mmol/l 4dNTP混合液（6）20 μl H₂O （7）0.2 μl 25 U/μl AMV反转录酶 9. 在含有RNA及寡核苷酸的微量离心管中，加入30 μl 上述延伸反应混合物，42℃温育1 h。 10. 在毎个微量离心管中加入105 μl RNA酶反应混合物，于37 ℃育15 min。 11. 加入15 μl 3 mol/l 乙酸钠和150 μl 酚/氯仿/异戊醇抽提，将上层水相移入一个干净管子中，再加入300 μl 乙醇沉淀DNA，沉淀物以100 μl 70%乙醇洗涤，用吸管吸去微量的乙醇残余，沉淀晾干5~10 min。 12. 用5 μl 终止/加样染料液重溶沉淀，65℃水浴加热5 min，在9%丙烯酰胺/7 mol/l 尿素凝胶中电泳至溴酚蓝到达凝胶的底部。 13. 干燥凝胶并用增感屏放射自显影。