质粒 DNA 用 0.1XTE(pH7.6) 溶解 DNA 至终浓度 25ug/ml; 每毫升培养基需要 50ul 质粒溶液。质粒 DNA 应用层折柱(见第 1 章方案 9) 或 CsCl-溴化乙锭梯度离心(见第 1 章方案 10) 纯化以获得最高转化效率。如果质粒 DNA 起始有限,可加入载体 DNA 将终浓度调至 25ug/ml。实验室内制备的真核运载 DNA 的转染效率通常比购买的 DNA 如小牛胸腺或鲑精 DNA 的转染效率高。运载 DNA 使用前通过乙醇沉淀或氯仿抽提除菌。
a. 在把磷酸钙-DNA 沉淀物加入细胞 2~6 h 后(±氯喹),吸去培养基,磷酸盐缓冲液洗涤细胞层。
b. 每平皿细胞加 1.5 ml 15% 甘油 1xHEPES 盐缓冲液,依据事先测试的最佳时间于 37°C 孵育细胞。
c. 吸去甘油,磷酸盐缓冲液洗涤细胞一次。
d. 加 5 ml 预热的完全培养基。细胞于孵箱中培养 1~6 天。继续步骤 6 检测转染 DNA 的瞬时表达,或者直接进行步骤 7 以获得稳定转化子。
丁酸钠处理细胞
丁酸钠的作用机制并不确定;但它是组蛋白脱乙酰基抑制剂(Lea and Randolph 1998), 推测丁酸钠会导致组蛋白过乙酰化形成使外来质粒 DNA 趋于转录的染色质结构(Workman and Kingston 1998)。
a. 甘油休克处理后,将 500 mmol/L 丁酸钠直接加入生长培养基(甘油处理的步骤 d)。细胞类型不同,所用丁酸钠的浓度也不同。例如:
CV-1 10 mmol/L NIH-3T 37 mmol/L HeLa 5 mmol/L CHO 2 mmol/L 其他细胞系所需浓度依经验而定。
b. 细胞于孵箱中培养 1~6 天。继续步骤 6 检测转染 DNA 的瞬时表达,或者直接进行步骤 7 以获得稳定转化子。
6. 若要检测细胞转染后导入 DNA 的瞬时表达,可在转染后 1~6 天收获细胞。杂交分析 DNA 或 RNA。通过体内代谢标记进行放射免疫、免疫印渍、免疫沉淀或测定细胞提取物的酶活性来分析新合成蛋白。 为减小不同培养皿之间转染效率的差异,最好(1)用每一构建体转染数个培养皿;(2)孵育 24 h 后用胰酶消化细胞;(3)将细胞汇集起来;以及(4)重铺细胞于数个培养皿上。
7. 分离稳定转染体
a. 用非选择性培养基中孵育细胞 24~48 h, 使转染的 DNA 有足够时间表达。
b. 胰酶消化细胞并重铺细胞于选择性培养基中,或者直接加选择性培养基。
c. 每 2~4 天更换培养基,持续培养 2~3 周,目的是清除死细胞残骸,促进抗性细胞生长。
d. 克隆独立菌落、繁殖,以用于检测(方法见 Jakoby and Pastan 1979 或 Spector et al.1998b[《细胞实验手册》的第 86 章])。
e. 用预冷的甲醇固定细胞 15 min, 然后室溫下用 10%Giemsa 染色 15 min, 流水冲洗,这样可以纪录细胞克隆数目。 根据稳定转染效率确定转染细胞的稀释度,重铺细胞产生独立克隆,不同细胞系的转染效率会相差几个数量级(如见 Spandidos and Wilkie 1984)。转染效率决定于细胞类型 [既使同一细胞系的不同克隆或不同传代数也可能出现显著差别(Corsaro and Pearson 1981,Van Pel et al.1985)]、导入 DNA 的性质及相关转录控制信号的功效、用于转染的 DNA 量。