一、附加方案,请参考 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2015/09/B1442910480png_small.jpg
二、蛋白质重折叠方法,请参考 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2015/09/A1442910608png_small.jpg
三、包涵体复性常见问题分析
1. 包涵体复性原则
低浓度,平缓梯度,低温。4 n( O5 ~0 q8 D;
2. 怎样洗涤包涵体?
通常的洗涤方法一般是洗不干净的,可以先把包涵体用 6M 盐酸胍溶解充分,过滤除去未溶解的物质,注意留样跑电泳,然后用水稀释到 4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳,如此类推可以一直稀释到合适的浓度,可以找到一个合适去除杂质的办法,其实这就是梯度沉淀的方法,比通常的直接洗脱效果好。
3. 对于尿素和盐酸胍该怎么选择
尿素和盐酸胍属中强度变性剂,易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用,所需浓度尿素 8-10M,盐酸胍 6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱,溶解度为 70-90%,尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐,对重组蛋白质的氨基进行共价修饰,但用尿素溶解具有不电离,呈中性,成本低,蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点,故目前已被广泛采用。
盐酸胍溶解能力达 95%以上,且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。
4. 8M 尿素溶解的包涵体溶液应如何保存?
在 4 度放置半个月,都没什么问题 。在室温放置超过 48 小时,可能会对目的蛋白有影响,因为尿素在碱性条件下可使一些氨基酸酰基化,所以早些处理 BI 溶液比较好。
5. 复性时的蛋白浓度是?
一般使用浓度为 0.1-1mg/ml,太高的浓度容易形成聚体沉淀,太低的浓度不经济,而且很多蛋白在低浓度时不稳定,很容易变性。
6. 蛋白复性后浓度低
蛋白可能是在复性的过程中发生降解了。可以将复性好的蛋白浓缩一下跑胶看看。复性过程一般都是低浓度蛋白,需要保证分子间有足够的折叠空间。一些未正确折叠的蛋白就存在于沉淀中,可能沉淀看不出来,复性后的蛋白高速离心看看。
7. 复性中蛋白析出是怎么回事?该怎么处理?
出现蛋白析出,肯定是条件变化太剧烈了。复性应该采取复性液浓度和 PH 值逐渐变化的方法,例如根据包涵体的溶液成分,每隔 1 个 PH 或浓度值配置一种溶液,逐步透析到正常。此外透析时必须浓度极低,条件温和,使蛋白质能够正确折叠。但是复性的比率应该很低。若加变性剂尿素可加到 2M,盐酸胍可加到 1-1.5M;另外可将甘油浓度增加,范围可在≤30%,且在复性样品中也可加适量甘油。
8. 复性效果的检测
根据具体的蛋白性质和需要,可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。
(1)凝胶电泳:一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质,或用非还原的聚丙 烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。
(2)光谱学方法:可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱(CD)等,利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测,但一般只用于复性研究中的过程检测。
(3)色谱方法:如 IEX、RP-HPLC、CE 等,由于两种状态的蛋白色谱行为不同,
(4)生物学活性及比活测定:一般用细胞方法或生化方法进行测定,较好的反映了复性蛋白的活性,值得注意的是,不同的测活方法测得的结果不同,而且常常不能完全反映体内活性。
(5)黏度和浊度测定:复性后的蛋白溶解度增加,变性状态时由于疏水残基暴露,一般水溶性很差,大多形成可见的沉淀析出。
(6)免疫学方法:如 ELISA、WESTERN 等,特别是对结构决定簇的抗体检验,比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。 本实验来源于分子克隆实验指南(第三版)下册,作者:〔美〕J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔。 |