2. 加入 90ulTE(pH7.6), 将混合物稀释至 100ul,68°C 加热 10 min 灭活多核苷酸激酶。
3. 测量 32P 转移到寡核苷酸上的效率,按以下过程操作,经 DE81 滤纸层析估计比活。
a. 剪下一条约 1cm 宽,7~10 cm 长的 DE81 滤纸,用软芯铅笔在距离一端 1.5 cm 处划一条平行的细线。标记层析开始的原点。
b. 在原点处点 1.0ul 稀释的磷酸化反应物。在 250 ml 烧杯中加入约 25~50 ml 的 0.2 ml/L 甲酸铵,使其深度达 0.5 cm 左右。将 DE81 滤纸条垂直放在烧杯中,使位于原点的放射性样品刚好在缓冲液上方。用一块玻璃板或铝箔盖住烧杯,使层析逐渐进展直至溶剂迁移的前端接近烧杯顶端。
c. 用莎伦包装膜包裹 DE81 滤纸条,用很短的时间进行放射自显影。以显影的 X 射线胶片为基准,切下溶剂前端带放射性的区域、原点区域和含放射性的其他区域。用液闪计数器测定每一部分的放射性同位素强度。 寡核苷酸保留在原点,而 ATP 和无机磷与溶剂迁移的方向相同。无机碘迁移稍落后于溶剂前沿,而 ATP 位于原点和无机磷之间的同等距离将来自 [γ-32P]ATP 的磷酸转移至寡核苷酸上导致原点出现放射性物质,由寡核苷酸摩尔数计箅出放射性标记探针的比活以及 [γ-32P]ATP 在反应中的比活和将放射性转移至寡核苷酸上的效率。步骤 1 中大于反应混合物 50% 的放射活性应被转移到寡核苷酸上。