3. 用无菌牙签或接种环将菌落逐一地转移至实验板的滤膜上和含有选择性抗菌素的主板上(没有滤膜)。按照板下方的方格将菌落划成 2~3 mm 的短线或点,每一菌落在两块板中的位置相同。
一块 90 mm 板可划 100 个克隆。
4. 最后在滤膜和主琼脂板上各划一个含非重组质粒(如 pUC) 的克隆。
阴性对照对于用放射性探针区别空质粒和重组质粒是必要。从重组质粒的限制酶切产物和琼脂糖电泳中提取的 DNA 片段常被质粒 DNA 序列污染,当污染的 DNA 片段用作杂交探针进行转化克隆的 Grunstein-Hogness 筛选时,就会造成麻烦。
5. 倒置琼脂板置于 37℃ 培养直至菌线的宽度校至 0.5~1.0 mm ( 通常需 6~16 h)。
这一阶段,如细菌生长仍然很快,滤膜应转至含有氯霉素的琼脂板,再于 37℃ 进一步培养 12 h(Hanahan and Meselson 1980,1983)。这个扩增的过程只有在重组质粒的拷贝数预计很低的情况下(如插入的是较大的外源 DNA 片段 ),或当简并度较高的寡核苷酸用作探针时,是必要的。克隆的 DNA 片段通常很容易通过杂交被检出,不需要预先进行重组质粒的扩增。扩增只对那些以松散方式复制的质粒是有效的。