热稳定 DNA 聚合酶(例如,PfuDNA 聚合酶) 本方案所述工作条件适合于 Pfu Turbo DNA 聚合酶。然而这一工作条件也可适合于其他热稳定 DNA 聚合酶或聚合酶混合物。Stratagene 公司销售的 Pfu 有三种形式:天然产生的由克隆的基因表达生产的重组酶以及由重组 PfuDNA 聚合酶和一个新的特性未知的但能够提髙扩增产物的产量而不改变 DNA 扩增精确度的热稳定_因子组成的 PfuTurbo 酶。厂商声称 Turbo DNA 聚合酶能够扩增长度为 15kb 的 DNA 片段。按我们的经验,当双链质粒 DNA 的长度超出 7~8kb 时扩增效率降低。
3. 在微型离心机上 4°C 离心 10 min 收集变性的质粒 DNA。小心弃去乙醇上清,用 150ul 70% 乙醇清洗沉淀物。重新离心 2 min 后弃上清,室温下使所有的乙醇蒸发。将 DNA 重新混悬在 20ul 水中。 理论上不需要将质粒 DNA 模板变性。如果忽略碱变性步骤,超螺旋的天然双链 DNA 将在 PCR 的第一次循环过程中经 94°C 加热变性。需要步骤 1 和 2 的原因是由于质粒 DNA 在碱性环境中变性后所处的状态。在 0.2mol/LNaH 溶液中. 质粒 DNA 可折叠成高密度不可逆的变性状态,用这样的质粒 DNA 做 PCR 模板. 转化细菌的可能性极小。因此大大降低了含未突变野生型 DNA 克隆的背最(Du et al.1995,Dorrell et al.1996)。相比而言,尽管 PCR 第一个循环 95°C 的温度打破了 DNA 双螺旋结构,但并没有必定摧毀质粒 DNA 的转化能力。未经突变的亲本质粒 DNA 分子在转化后获得的克隆中含有较高的比例。直到实验的后期,当研究人员面临筛选克隆、鉴定含有突变 DNA 的任务时,碱变性的意义才显示出来。如果诱变效率低,且 Dpn Ⅰ筛选无效时,含野生型 DNA 分子充隆的比例之髙往往是无法接受的。
4. 用 0.5 ml 的无菌微量离心管,设置一系列含有不同量(例如 5,10,25,50ng) 质粒 DNA 和恒定数量的两种寡核苷酸引物。
如果厂商提供的 10X 噬菌体 T4 连接酶已含有 ATP。省去上述连接反应中的 ATP 成分。 尽管理论上已弄懂了有利于环状单体形成的连接反应条件(Collins and Welssman 1984), 但实际上却很难做到。为了有利于形成分子内环化而不是分子间以链状连接,DNA 分子的摩尔浓度必须很低。然而当使用反向 PCR 扩增产生 DNA 时,因为无法得知末端未受损伤的全长 DNA 在 PCR 产物中的比例,因此很难计算出适当的 DNA 浓度。
12. 苯酚: 氯仿抽提 DNA 连接产物两次,乙醇沉淀收集 DNA。将 DNA 沉淀重悬在 45ul 水中,每管加入 5ul l0 倍的 DpnⅠ缓冲液。