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大肠杆菌的电击转化实验

大肠杆菌的电击转化实验

标签：大肠杆菌电击转化分子克隆实验指南第三版第1章方案26

大肠杆菌的电击转化实验可以用于：更为简便快捷地进行转化。

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大肠杆菌的电击转化实验

实验方法原理	转化（transformation）是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表型发生相应变化的现象。该现象首先发现于细菌。也是细菌间遗传物质转移的多种形式中最早发现的一种，它不同于通过噬菌体感染传递遗传物质的转导以及通过细菌细胞的接触而转移DNA的细菌接合。
实验材料	质粒 DNA
试剂、试剂盒	甘油纯水 SOC 培养液
仪器、耗材	CYT LB SOB 琼脂板电击仪电击杯冰浴盒液氮
实验步骤	一、材料准备 1. 缓冲液和溶液甘油（10% V/V）（分子生物级），冰上预冷。纯水（Milli-Q 级或与之相当的级别，用预先处理的 Nalgene 滤膜（0.45 μm 孔径）过滤除菌，放置冰上。 2. 核酸和寡核苷酸质粒 DNA ( 重组质粒） 3. 培养基 (1) CYT，冰上放置。 10% ( V/V ) 甘油，0.125% ( m/V) 酵母粉，0.25% ( m/V）蛋白胨，本配方来自 Tung 和 Chow (1995)。 (2) LB，预加温至 37℃ (3) SOB 琼脂板，含 20 mmol/L MgSO₄ 和适当的抗生素。标准的 SOB 琼脂板含 10 mmol/L MgSO₄。 (4) SOC 培养液每个转化反应约需 1 ml。 (5) 专用设备电击仪和电极间距为 0.1~0.2 cm 的电击杯。冰浴盒液氮二、方法 1. 细胞的制备 (1) 从新鲜的琼脂板上挑取一个大肠杆菌单菌落，接种于含 50 ml LB 培养液的锥形瓶中，于 37℃ 摇动（250 r/min 的摇床）培养，过夜。 (2) 接种两份 25 ml 的过夜培养物分别到盛有 500 ml 预热 LB 培养基的 2 L 锥形瓶中，于 37℃ 摇动（300 r/min ) 培养，每隔 20 min 测量一次 OD₆₀₀ 值。 (3) 当 OD₆₀₀ 值达到 0.4 时，迅速将培养物置于冰浴中 15~30 min，不时缓慢摇匀以保证内容物充分冷却。将离心管置于冰上预冷，为下一步做准备。 (4) 将细菌转移至冰冷的离心管中，4℃ 用 SorvalI GSA 转头（或与之相当的转头）以 1000 g ( 2500 r/min ) 离心 15 min，以回收细胞。倒去培养液，用 500 ml 冰冷的纯水重悬沉淀。 (5) 4℃ 用 Sorvall GSA 转头（或与之相当的转头）以 1000 g（2500 r/min）离心 20 min，以回收细胞。倒去培养液，用 250 ml 冰冷的 10% 甘油重悬沉淀。 (6) 4℃ 用 Sorvall GSA 转头（或与之相当的转头）以 1000 g（2500 r/min）离心 20 min，以回收细胞。倒去培养液，用 10 ml 冰冷的 10% 甘油重悬沉淀。 (7) 4℃ 用 Sorvall GSA 转头（或与之相当的转头）以 1000 g（2500 r/min）离心 20 min，以回收细胞。小心倒掉上清液，再用连在真空器上的巴斯德吸管吸去管壁上的残留液体。加 1 ml 冰冷的 GYT 培养液重悬沉淀。 (8) 100 倍稀释上述悬液后测量 OD₆₀₀ 值。用冰冷的 GYT 培养液将其稀释至浓度为 2X10¹⁰~3X10¹⁰个细胞/ml ( 1.0OD₆₀₀= ~2.5X10¹⁰ 个细胞/ml)。 (9) 将 40 μl 上述悬液转移到冰冷的电转化仪的电击杯中（约 0.2 cm 间隙），检査电击时是否有短路现象。如果有，那么剩下的细胞悬液用冰冷的 GYT 培养液洗一次，使细菌悬液的电导足够低（<5 mEq )。 (10) 如果要立即用刚制备的电激感受态细胞，请接步骤 (12)。如果要冻存在 -70℃，将悬液按 40 μl/份分装到冷却的无菌 0.5 ml 微量离心管中，封紧管口，没入液氮中快速冰冻感受态细胞。存于 -70℃ 备用。 (11) 需要用冻存的电转化感受态细胞时，从 -70℃ 冰箱中取出适当的份数，室温下待融解后将管转移至冰上。 2. 电击转化 (12) 吸取 40 μl 新鲜制备（或冻融）的感受态细胞入 0.5 ml 冰冷的微量无菌离心管中。与电转化仪样品池一起放在冰上冷却。 (13) 以 1~2 μl 的体积向每一微型离心管中加入 10 pg~25 ng 的待转化 DNA，置于冰上 30~60 s。包括所有的阳性与阴性对照。用电击转化的 DNA 最好在的浓度范围溶解在水或 TE ( pH 8.0) 中。如果用 DNA 连接产物直接进行电击转化，两种选择都是可行的。既可以用 H₂O 将连接产物稀释 10~20 倍，也可用离心层析柱纯化 DNA 或采用酚：氯仿萃取和乙醇沉淀的途径提取 DNA。沉淀的 DNA 要用 70% 乙醇洗涤，而后用 TE ( pH 8.0) 或 H₂O 溶解，浓度应在 1~10 μg/ml。对于构建文库，高的转化效率是必需的，而共转化则是要避免的。DNA 的总浓度应低于 10 ng/ml ( Dower et al. 1988)，用超螺旋质粒转化 E.coli，常规转化 10~50 pg 的 DNA 量就足够了。如果是用亚克隆的质粒进行转化，应将连接产物稀释至浓度为 25 ng 的 DNA。 (14) 调节电击仪，使电脉冲为 25 μF，电压 2.5 kV，电阻 200 Ω。 (15) 将细菌与 DNA 混合物加至冷的电击杯内，轻击液体以确保细菌与 DNA 悬液位于电击杯底部。擦干电击槽外的冷凝水和雾气。将电击杯放进电击仪。 (16) 按上述设定的参数，启动对细胞的电脉冲。仪器应显示出 4~5 ms 具有 12.5 kV/cm 的电场强度。电击杯内的离子可增加溶液的电导，并在含有细胞和 DNA 的溶液中产生电流和弧光或放电。发射电脉冲时，由于电击槽内爆音的存在使孤光通常显得很明显。电击槽内电荷不均匀的转移可极大地降低转化效率。溶液的电导大于 5 mEq (10 mmol/L 的盐或 20 mmol/L Mg²⁺ 的溶液）就会产生弧光，高温也会促使弧光产生。如果弧光只有在 DNA 存在时才产生，就应在步驟13制备 DNA 的过程中去除离子。 (17) 脉冲结束后，尽可能快地取出样品池，室温下加入 1 ml SOC 培养液。有些研究者认为，室温下加入培养液可造成热激，从而提高转化效率。 (18) 将细胞转至 17X100 mm 或 17X150 mm 聚乙烯试管，于 37℃ 在轻柔振荡下培养 1 h。 (19) 取不同体积（每 90 mm 板最多可达 200 μl) 的电击转化细胞，铺于含有 20 mmol/L MgSO₄ 和适当抗菌素的 SOB 琼脂板。用超螺旋质粒转化，可以预计转化子会很多，因此用无菌接种环接种少许菌液在含有适当抗菌素的琼脂板（或板的局部）划线。然而，如果预计到转化子的数量很少，最好接种 5 块板，毎块板的菌液接种量为 200 μl。由于电击过程中产生的大量死细胞对稀少转化子的生长有抑制作用，所以我们不推荐采用浓缩的菌液只接种一块板的方法。 (20) 室温下待培养板中的液体被完全吸收。 (21) 倒置培养板于 37℃ 培养，转化克隆应在 12~16 h 内出现。
注意事项	同一种细菌也可以由于基因型的改变而改变转化效率。细菌的限制性核酸内切酶能够分解外来的DNA，所以如果用限制酶失活的突变型菌株作为转化受体时可以提高转化效率。通过筛选也可以得到转化效率显著下降的突变型，包括吸附能力、吸收能力和整合能力下降的突变型。某些转化效率降低的突变型对于紫外线格外敏感，这一性质也是许多丧失了DNA损伤修复能力和丧失重组功能的突变型的特性，可见转化过程中的DNA的整合和DNA损伤修复以及基因重组都涉及某些相同的酶。
其他	基因型完全相同的细菌可以由于生理状态的改变而改变转化效率。能够吸收外源DNA的生理状态称为感受态。许多细菌的感受态都在对数生长期的后期迅速出现，经过一段时间以后便消失。感受态的细菌和非感受态的细菌相比，转化效率可以高出万倍。本实验来源《分子克隆实验指南第三版》黄培堂等译。

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