b. 从一个由重组噬菌体产生的新生长的噬菌斑中分离单链模板 DNA 和双链复制型 DNA。 利用 M13 噬菌体载体进行克隆的方法以及制备单链和复制型噬菌体 DNA 的方法请参阅第 3 章方案 3、4 和 6。
c. 限制性内切核酸酶分析复制型 DNA, 单链 DNA 序列分析方法鉴定重组克隆的正确性。 Kunkel 过程也可用于从噬菌粒载体产生掺入尿嘧啶的单链 DNA(McClary et al.1989 , Wang et al.1989.Liuetal.1990, 综述文章见 Hagemeier l996)。本文中首先用含有靶序列的双链噬菌粒 DNA 转化 E.coli CJ236(或其他表型为 dut-ung-F'的菌株)至氨苄青霉素抗性。辅助噬菌体重复感染含靶序列噬菌粒 DNA 的细菌,使噬菌粒 DNA 的复制形式由双链 DNA 转变成单链 DNAs(请参阅第 3 章方案 8)。随着在尿苷培养基中生长,部分胸腺嘧啶位置上掺入尿嘧啶的单链 DNA 被包装进病毒颗粒并分泌进培养液。分离该 DNA (按步骤 5 所描述的)用作定点诱变的模板(方案 2)。使用噬菌粒载体不需要定点诱变前将起始靶 DNA 克隆进 M13 噬菌体载体。
2. 用灭菌的巴斯德滴管将一个单独的由重组 M13 噬菌体产生的噬菌斑转移到含 1 ml 2XYT 培养液的微量离心管中。
3.60°C 孵育 5 min 灭活细菌细胞(杀死细菌细胞防止在下一轮噬菌体繁殖过程中继续产生含胸腺嘧啶的病毒 DNA 是非常重要的)。剧烈振荡离心管 30s, 释放出包裹在顶层琼脂中的噬菌体。4°C 超速离心 2 min, 以去除死菌体和细胞碎片。