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细胞集落形成

细胞集落形成

标签：细胞集落

细胞集落形成主要用于干细胞和肿瘤的研究。

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细胞集落形成有问题？丁香实验库全新大升级，10000+ 实验方法任你选

细胞集落形成

实验方法原理	细胞集落形成实验是检测培养细胞增殖能力的有效方法之一。由于它是通过检验活细胞的增殖能力，因此避免了在生长曲线绘制时将死细胞或不能再分裂细胞计数在内而导致的实验结果误差。细胞集落形成实验的原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代形成一个细胞群体，称为集落(colony)。每个克隆均包含50个细胞以上，大小在0.3～1.0 mm之间。通过计算集落形成率(colony forming efficiency)，来测定测试细胞的增殖能力。
实验材料	Hela细胞
试剂、试剂盒	Giemsa染液胰酶血清培养液碘琼脂
仪器、耗材	培养皿细胞计数板离心机离心管 CO2培养箱水浴锅
实验步骤	1.平板克隆形成试验本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的正常细胞和肿瘤细胞。 (1)对指数生长期细胞，采用常规消化传代方法，制成细胞悬液。 (2)细胞悬液反复吹打，使细胞充分分散，单个细胞百分率应在95%以上。细胞记数，并用培养基调节细胞浓度，待用。 (3)根据细胞增殖能力，将细胞悬液倍比稀释。一般按照每皿含50、100、200个细胞的浓度分别接种5ml细胞悬液到培养皿（直径 60mm ）中，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀。 (4)培养皿置 37℃ 、5% CO₂中培养2~3周，中间根据培养液pH变化适时更换新鲜培养液。 (5)当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，空气干燥。甲醇固定15分钟，弃甲醇后空气干燥。用Giemsa染液染色10分钟，流水缓慢洗去染液，空气干燥。 2.软琼脂集落形成试验本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。利用琼脂液无粘着性又可凝固的特性，将肿瘤细胞混入琼脂液中，琼脂液凝固使肿瘤细胞置于一定位置，琼脂中肿瘤细胞可能向周围作全方位的移动，因此可以用来检测肿瘤细胞的主动移动能力。肿瘤细胞在适宜培养基中又可以增殖，从而可以测定肿瘤细胞克隆形成率。造血系统软琼脂集落形成试验方法相同，主要用于有关细胞分化的研究，但使用培养基不同。（1）同上（1）~（3）步骤。（2）调整细胞悬液密度为1x10³个/ml细胞。（3）制备底层琼脂，完全溶化的5%琼脂和 37℃ 左右预温的新鲜完全培养液以1：9比例在 40℃ 均匀混合，加入培养皿（直径 60mm ）中，每皿含0.5%琼脂培养基2ml，室温下琼脂完全凝固。（4）制备上层琼脂,取 37℃ 不同密度梯度(按照每皿含50、100、200个)的细胞悬液1.5ml移入小烧杯中，加入 40℃ 、5%琼脂等体积混匀，即成0.25%半固体琼脂培养基。配好的半固体琼脂培养基立即加入铺有底层琼脂的培养皿中，室温下琼脂凝固。 37℃ 、5%CO₂静置培养2-3周。
注意事项	1. 细胞悬液中单个分散细胞应多于90％。 2. 平板培养早期尽量不要晃动培养皿，以免细胞脱落，导致实验误差增加。 3. 平板培养期间应及时更换新鲜培养基，保持培养物获得充分的营养成分。 4. 软琼脂培养时，注意在琼脂与细胞混合时温度不要超过40℃，以免烫伤细胞。 5. 接种细胞密度不宜过高。
其他	来源《细胞生物学实验技术》

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