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慢病毒包装实验

标签: 慢病毒 包装

慢病毒载体包装之后成为假病毒颗粒后,可用于:(1)感染原代培养细胞;(2)制备稳定表达/沉默特定基因的单克隆细胞株;(3)in vivo的基因操作、转基因动物,特别是转基因大鼠的制备。

详细
实验方法
  • 慢病毒包装实验
实验方法原理 慢病毒是反转录病毒的一种,具有反转录病毒的基本结构和特性:整合入宿主细胞基因组,长期表达,可用于转基因动物制备;但也有不同于反转录病毒的组份和特性:比反转录病毒具有更高的滴度,不仅可以感染分裂期细胞,更重要的,还能感染非分裂期的细胞。利用慢病毒载体,可以研究启动子的调控、过表达特定基因或沉默特定基因。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
以六孔板中的1孔为例,每个样品需要1×106个293T细胞。
 
1. 取1.5ml灭菌EP管,加入1.5μg包装混合质粒和0.5μg表达质粒以及250μl的无血清培养基。轻柔混匀,室温孵育5min。
 
2. 取1.5ml灭菌EP管,取9μl 脂质体2000l溶于250μl无血清培养基中。轻柔混匀,室温孵育5min。
 
3. 将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。室温孵育20min
 
4. 用胰酶消化并记数293T细胞。用含血清的培养基重悬细胞。
 
5. 在六孔板中每孔,加入1ml含血清的生长培养基,再加入DNA-脂质体复合物。
 
6. 将1ml重悬的293T细胞(1×106个细胞/ml)加入到平板中。37℃CO2孵箱中孵育过夜。
 
7. 移除含有DNA-脂质体复合物的培养基移除,代之以DMEM(含丙酮酸钠和非必须氨基酸)。
 
8. 转染后48-72h收获含病毒的上清。3000 rpm 离心20min,去除沉淀。
 
9. 病毒上清-80°C贮存。
 
包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。
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注意事项

1.慢病毒理论上可以包装5~7Kbp的片段,但过大的片段包装会影响病毒的出毒效率,导致获得的病毒滴度较低,影响病毒感染效果。因此一般建议最好将包装的片段控制在1.5Kbp以内。

    

2.病毒载体易突变和丢失,克隆过程中可能出现质

粒的包装信号突变或大小不等的片段丢失,导致无法成功包装出病毒。因此建议构建好含有目的基因的克隆载体(尤其插入片段大于1.5Kbp)后首先进行测序,以确保关键序列都正确无误。

    

3.包装细胞多选择为293T或293FT。要求细胞生长旺盛、状态良好,避免过密生长和体外传代次数过多。

    

4.转染时对质粒纯度要求较高,最好为去掉内毒素

的超螺旋质粒,以提高转染效率。多采用磷酸钙转染方法,既节约成本又可获得高的转染效率(一般可达到80%~95%)。

    

5.无论是三质粒或四质粒慢病毒系统,转染的各质

粒之间的比例非常重要,直接影响出毒效率。不同公司提供的质粒有所差别,因此无法一概而论,需要根据给出的比例进行调整优化。


6.转染前,细胞密度控制在50%~60%为佳。转染前4~8h换液,转染后不换液。转染第2天添加丁酸钠(TPA)可明显提高出毒率,之后8h再换液。每次换液前应将培养基预热至37。C,换液时动作轻柔以防细胞漂起。


7. 一般情况下,转染48h后收获得到的病毒颗粒最多,但也与当时细胞状态、生长速度和培养基pH值有关。收获病毒时培养基应呈红色,若过酸呈现黄色则会降低病毒收获率。

    

8. 不同厂家和批次的血清对病毒的产量影响很大,

需要筛选。

    

9.病毒液避免反复冻融,否则明显降低效率。

    

10.一般情况下,病毒液于-80"C中可保存1年,但建议半年之后重新检测病毒滴度。

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其他
构建慢病毒载体的过程比较复杂,自己构建既费时又费钱,一般情况下委托生物公司代为构建比较好。目前国内已有公司提供慢病毒的包装,研究人员只需将欲包装的基因序列号或碱基序列提供给公司,即可在2~3个月内拿到纯化好的3×107—30×107Tu的病毒颗粒,可直接用于细胞水平或动物体内实验,所有费用约为1.8万。

来源《肿瘤分子生物学与细胞生物学实验手册》,《细胞与分子生物学常用实验技术》。
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