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标签： SDS-PAGE 电泳 蛋白质纯化与鉴定实验指南 附录5 一
按所用小型平板凝胶装置调整溶液体积，胶板大小约在8X10X0.15cm。在此大小范围内有几种形式可以利用。制胶的装置有玻璃板、塑料隔条（通常厚度为0.1~0.2cm)和铸胶时成孔用的Teflon梳子。下面逐步示教SDS-PAGE的操作程序。本实验来源于蛋白质纯化与鉴定实验指南，作者：朱厚础。
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| 试剂、试剂盒 | |
|---|---|
| 实验步骤 |
铸分离胶（下层胶) 装置的清洗 为使角蛋白的污染减至最少，将玻板、梳子和隔条浸泡在含强碱性去垢剂〔2%RBS 35 液（Pierce Chemical Co.)〕提浓物的水溶液（每 1000 ml 水加 20 ml 提浓物中。可将去垢剂溶液置于一带盖的盆中，盆中放一支架，将玻板悬置于支架上至少保持 10 min(或过夜)。此外，努力保持凝胶材料和溶液尽可能是无尘的。有时要用缓冲液对吸管进行预冲洗，以除去可能沉积于吸管内的灰尘颗粒。操作时要一直戴手套并经常变动它们的位置。用不会留下颗粒的纸巾（如 Kimwipes 纸巾）擦干玻板，或用甲醇或丙酮洗涤玻板并在通风橱中风干。 分离胶的混合 在对待测蛋白质的大小所作最佳估计的基础上，选择合适的丙烯酰胺浓度。下表概括了制备不同百分比的丙烯酰胺/双丙烯酰胺混合物所需成分的用量。表的上方给出了最小待测蛋白质的分子量范围。  分离胶的灌注 1) 将丙烯酰胺/双丙烯酰胺、H20、4x 分离胶缓冲液混合于带侧臂口的小号 (25 ml）爱伦美氏烧瓶。 2) 用塞塞住瓶口，混合物真空脱气 10 min。 3) 加 APS, 温和但彻底混匀。尽量避免产生气泡。 4) 加 TEMED。温和但迅速混匀。 5) 用经水预洗净的巴氏吸管灌注胶液，直至液面高度离玻板顶部约 1 cm 处。 6) 用预洗净的巴氏吸管在胶液上面均匀布一层异丁醇（2-甲基-1-丙醇）。异丁醇层应高约 2 mm。 7) 分离胶至少聚合 1 h。 铸压缩胶（上层胶） 压缩胶的混合  压缩胶的灌注 1) 将丙烯酰胺/双丙烯酰胺、H2O、4x 分离胶缓冲液混合于带侧臂口的小号(25 ml) 爱伦美氏烧瓶。 2) 用塞塞住瓶口，混合物真空下脱气 10 min。 3) 分离胶聚合后，倾出上层液体异丁醇和未聚合的丙烯酰胺。 4）用蒸馏、去离子水洗涤胶的上部。 5) 用压缩胶液洗涤胶的上部。 6) 将梳子插入玻板之间。 7) 加 APS, 温和但彻底混匀。努力避免产生气泡。 8) 加 TEMED。温和但迅速混匀。 9) 用预先经水洗净的巴氏吸管灌注压缩胶液。 压缩胶应在 10 mm 内聚合。在 2 h 内使用。 电泳 样品的制备 1) 将沉淀或冻干的各样品分别置于 1.5-ml 具盖聚丙烯离心管中，各加入 5~20ul 含 2-巯基乙醇的 1X 样品缓冲液（配方见 p.257)。短暂震荡混合后立即置于沸水浴中支架上 5 min。 2）样品冷却至室温，微型离心机短暂离心（~10s)。 加样 1）小心地取出梳子，将聚合的凝胶安置于电泳槽中。上、下槽中加入电泳缓冲液 (1X)(配方见 PP.256~257)，确保每个样品孔中都充满缓冲液。小心地去除样品孔中的所有气泡或额外的聚丙烯酰胺碎片。 2) 每个样品按合适的体积加样，对于 0.15 cm 厚的胶，通常最多加 15ul 样品因样品含 10% 甘油，样品会通过样品孔中的缓冲液而沉入孔底。 3) 当心样品不要溢出至样品孔间的分隔部而混合。用自动移液器上样应用出口极细的吸头，每个样品换一个吸头。 电泳 1) 将电极导线接至电源，黑的接于负极，红的接于正极 pH8.3 时，与 SDS 结合的蛋白质荷负电，它们将向正极迁移。 2) 压缩胶部分每块胶以 8mA 电流（恒流) 电泳。若两块胶在一个电泳槽内同时进行电泳，则以 16mA 电流进行电泳。在压缩胶/分离胶界面处，蛋白质样品将压缩成一窄带。 3) 当溴酚蓝进入分离胶时，每块胶的电流增至 18mA。 4) 溴酚蓝达到胶的底部时，即关掉电源，停止电泳。不应让溴酚蓝跑出底部。 溶液和缓冲液的配制 丙烯酰胺/双丙烯酰胺储液（30:0.8）(1000 ml) 30%(w/v) 丙烯酰胺 300 g 0.8%(w/v) 双丙烯酰胺 8 g 加去离子蒸馏水，至终体积 1000 ml。经 0.22-um 膜过滤。存于 4°C 暗处。 分离胶缓冲液（4x) 1.5mol/LTris-HCl(pH8.0) 0.4%(w/v)SDS  加去离子蒸馏水, 至所需终体积。室温下用 HCl 调 pH 至 8.8。经 0.22-um 膜过滤。存于 4°C 压缩胶缓冲液 (4X) 0.5mol/LTris-HCl(pH6.8) 0.4%(w/v)SDS  加去离子蒸馏水, 至所需终体积。室温下用 HC1 调 pH 至 6.8。经 0.22-um 膜过滤。存于 4°C。 电极缓冲液 (4X) 0.1mol/LTris 0.768mol/L 甘氨酸  加去离子蒸馏水，至所需终体积。不必调 pH。此比例时 Tris 碱-甘氨酸的 pH 应为 8.3。室温下存于大容器（酸坛）中。 SDS(10%;w/v) (100 ml) 取 10 gSDS 溶于去离子蒸馏水中，至终体积 100 ml。室温下存于洁净瓶中。 电泳缓冲液（1X) 1/4 体积的 4x 电极缓冲液与 3/4 体积的去离子蒸馏水混合。然后加 1/100 体积的 10%SDS 至终浓度 0.1%(w/v)SDS。实例如下：  样品缓冲液 (2X) 储液 0.25mol/LTris-HCl(pH6.8) 4%(w/v)SDS 20%（v/v) 甘油 痕量溴酚蓝 配制此缓冲液时，应极小心，戴手套，并避免角蛋白（皮肤上即存在此蛋白) 对缓冲液的污染。  加 H2O 至 100 ml 终体积。此缓冲液可室温下保存或等分冻干保存，但用前必须温热以确保 SDS 于溶液中。应保证反复使用此溶液的同一储液而不被污染。等分保存将有助于避免这个问题。 含 2-巯基乙醇的样品缓冲液（1X) 用前配制样品缓冲液的工作液，稀释 2X 样品缓冲液储液（见上，加入 2-巯基乙醇至终浓度为 5%(v/v)。例如： 2x 样品缓冲液储液 100ul H20 90ul 2-巯基乙醇 10ul/200ul 过硫酸铵 (APS)(10%;W/V） 取 3 g 过硫酸铵，溶于去离子蒸馏水，至终体积为 30 ml。此溶液 4°C 下在短暂的数日内是稳定的，但建议，对每一组新胶均应新鲜配制。 |
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