震荡,使探针 DNA 混合物彻底混匀。聚乙烯醇较粘稠,只有充分震荡才能使探针 DNA 溶液完全混合。 注:1. 聚乙烯醇可能会促进因子与 DNA 的结合。它大概是作为“分子拥挤剂(molecularcroudingagent)"而起作用的,分子拥挤剂 [”体积排阻剂(volumeexcluder)“] 可加大分子如蛋白质和 DNA 的有效浓度(可把它想象成分子海绵,它只吸水和小离子而不吸大分子 2. 竞争 DNA 可用可不用,但分析粗制的蛋白质组分时,用竞争 DNA 常常是有益的。 注意,加入竞争 DNA 的时间可能是一个重要参数。一般,竞争 DNA 与探针混合物一起加人,如本方案中 AP-1 的足迹分析。不过,在某些情况下,加入蛋白质组分和探针混合后再在毎个管中分别加入竞争 DNA, 可能会更好座。加入竞争 DNA 的最适时间应由实验定。
4) 将蛋白质组分直毕加于装有适量适当类型 (0.0moI/LKCl 或 0.1mol/LKC1) 的缓冲液 Z'的 f 反应管中。
5) 每个反应管中加入 25ul 探针 DNA 混合物,轻弹混合样品,置冰上孵育 15 min。同时,取一份 2.5 mg/ml DNA 酶 I 储液解冻。
7) 探针 DNA 和蛋白质组分孵育 15 min,临结束前,用冰预冷的水稀释 DMA 酶Ⅰ。然后颠倒并温和震荡,使之彻底混匀。 注:对于不含蛋白质的阴性对照反应,2ul 1:2000 倍稀释的 DNA 酶 I 可用于大多数 DNA 探针。而对于持定的 DNA 序列,DNA 酶 I 的最适用量可因序列不同而异,对与不纯蛋白质的反应,由于可能存在 DNAIII 抑制剂如肌动蛋白单体,通常需要多加一点 DNA 酶 I。粗制的蛋白质组分需要比正常多 20~100 倍的 DNASI。部分纯化的蛋白质组分需要比正常多 3~10 倍的 DMA 酶 I。纯的蛋白质组分不需要任何过量的 DNA 酶 I。对每个待分析的蛋白质组分,均必须确定其最适的 DNA 酶 I 稀释度。
8)从冰上取下一份 DNA 探针和蛋白质组分样品,室温放置 1 min。 注;足迹分析时,所有必需的东西自动移液器、溶液、定时器、震荡器,DNA 酶Ⅰ)均井然有序地摆放在--起是有益的。本操作程序进行得越顺当,足迹分析的结果将会越好(且重复性也越好)。