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HeLa 细胞核提取物的制备实验

标签: HeLa 细胞 核提取物 蛋白质纯化与鉴定实验指南 第二单元 实验 1

在本实验中,基本上是按Dignam等(1983)所述的方法从HeLa细胞制备核提取物的。这一基本方法大概是制备体外转录和DNA结合实验用因子的最常用的方法。本实验来源于蛋白质纯化与鉴定实验指南,作者:朱厚础。

实验方法
  • HeLa 细胞核提取物的制备实验
试剂、试剂盒
实验步骤
材料

HeLa 细胞(培养和保存条件见下文。我们也成功地使用过 CellexBiosciences 公司制备并冷冻的 HeLa 细胞)

甘油

液氮

MgCl6 H2O

硫酸铵

试剂

磷酸缓冲盐溶液(PBS)

缓冲液 G

缓冲液 H

缓冲液 D

TM 缓冲液+0.1 ml/L KCl

(配方,见"试剂的配制",PP.131~138)

操作程序

HeLa 细胞的培养与保存(12-L 规模)

1)HeLa 细胞对数生长至密度为 5X105 个细胞/ml, 温和收集细狍以免裂解。

2) 细胞用 PBS 洗涤一次,并再次收集。

3) 对每升原始培养液所得之细胞加 2 ml 缓冲液 G(即,对由 12L 培养液得到的细胞加 24 ml 缓冲液,再补加甘油至甘油的终浓度为 20%(v/v)。例如,由 12L 培养液可得大约 18 ml 体积的细胞,加入 24 ml 缓冲液 G 后,总体积达 42 ml。但因细胞占了一定体积而使甘油浓度仅为 17.1%,故必须再补加 1.5 ml 甘油,使甘油的终浓度达 20%。

4) 将细胞置液氮中冷冻,储存于-80℃ HeLa 细胞核的制备(12-L 规模)

除特别说明者外,所有溶液均应保持于 4℃,所有操作亦应在 4℃ 下进行。

1) 室温下,将 HeLa 细胞(由 12L 细胞密度约为 5X105 个细胞/ml 的培养液所得之细胞置水中解冻。应尽可能快地使细胞解冻,但不宜使细胞温度超过 4℃。加入含 lg MgCl2·6 H20/L 的 PBS,至终体积为 200 ml, 再用 BeckmanGSA 转头,3000r/min 离心 10 min, 收集细胞。

2) 用 200 ml 含 1g/L MgCl2·6 H20 的 1XPBS 洗涤细胞,用 BeckmanGSA 转头,3000r/min 离心 10 min, 收集细胞。

3) 细胞重悬于 60 ml 缓冲液 H。

4) 细胞置冰上孵育 15~30 min。

5) 用 Dounce 氏匀浆器(40 ml) 及 B 杵破碎膨胀的细胞,研磨 20 次。
注:重要的是细胞裂解后的操作要快,使转录因子因泄漏至核外而造成的损失减至最小。实际上,在胞质组分离心收集细胞核时的上清液中常见有高浓度的核转录因子。因此. 增加洗涤和离心的次数往往会使转录因子的得率降低。

6) 用 BeckmanSS-34 转头,3500r/min 离心 10 min, 收集细胞核。立即制备核提取物。从 12LHela 细胞培养液一般可获得约 12 g 细胞核。HeLa 细胞梭提取物的制备(12-L 规模)

除特别说明者外,所有溶液均应保持于 4,所有操作亦应在 4 下进行。

1) 取由 12LHeLa 细胞培养液制备的细胞核(如上所述或在冷水(4) 中解冻一份冻存的细胞核。

2) 将细胞核悬于 75 ml 缓冲液 D 中。
注:袖提缓冲液中的 0.42mol/L KC1 可用 0.42mol/LNaCl 来代替。

3) 磁力搅拌器搅拌 30 min。

4)100OOOg 高速离心 1 h, 沉淀细胞碎片。
注:对此步离心,建议用吊斗式转头如 BeckmanSW28) 而不用定角式转头。用后者会对细胞核产生不希望有的剪切作用。

5) 测上清液体积(通常为 70~75 ml)。
注:为制备供体外转录实验用的标准提取物,可将 100000 g 离心所得的上清液对含 0.1mol/LKCl 的 TM 缓冲液进行透析 6 另外, 也可将硫酸铵沉淀物见下文对 TM 缓冲液+0.1mol/LKC1 进行透析。0.42mol/LKC1 提取物中含有髙水平的组蛋白 H1, 它是转录作用的潜在阻遏物 (Crceton 等,1991)。硫酸铵沉淀可除去大部分组蛋白 II1, 因此,在样品对 TM 缓冲液+0.1mol/LKC1 进行透析前,最好先用硫酸铵对 0.42mol/LKC1 提取物作沉淀处理。

6) 每毫升上清液加 0.33 g 硫酸铵粉末,5~10 min 内缓缓加入。
注:在使用前约 5~10 min, 将硫酸铵晶体研碎。硫酸铵粉末有吸湿性,吸潮的疏酸铵难于准确称量。咖啡豆研磨器是研磨琉醆铵的好器具,比研钵和杵要好使得多。

7) 待所有硫酸铵溶解后,混合物用磁力搅拌器搅拌 30 min。

8) 用 BeckmanSS-34 转头,15000r/min 高速离心 15 min, 沉淀蛋白质。

9)将沉淀物溶于约 3.5 ml 的 TM 缓冲液+0.1mol/LKCl 中,并使溶液的终体积约为 5 ml。

10) 所得乳白色混合物用 BeckmanSS-34 转头,10000r/min 高速离心10min, 除去不溶物。

11) 上清液一般为乳白色,可直接上 S-300 柱进行凝胶过滤。用 Bradford(考马斯亮蓝法、以牛γ-球蛋白为参照,测定其蛋白浓度一般约为 50 mg/ml。

12) 如需要, 可将提取物置液氮中冷冻,-80°C 下可保存数月(甚至数年)。提取物融化时应尽可能得快些,这一点很重要。而要做到这一点,可将冷冻管置室温的水中,并去除可能在管周围形成的冰。提取物融化后,重要的是用 BeckmanSS-34 头,10000r/min 高速离心 10 min, 除去不溶物另一办法是将此提取物对 TM 缓冲液+0.1mol/L KCl 透析数小时,至样品的电导率与缓冲液完全相同,该细胞核提取物即可用于体外转录实验。
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