标签: 菌落 PCR 重组体 PCR实验指南 章节28 方案4
菌落PCR分析克隆的重组体实验可应用于:(1)分析由转化细胞产生的菌落是否含有重组插入片段;(2)鉴定插入物的存在和方向。
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1. 设计引物很关键。一般如果是定向克隆,用载体上的通用引物即可;如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆(如单酶切或平末端连接),一条引物用载体,一条引物用目的基因上的,这样就可以比较方便的鉴定了,而且错误概率很低。PCR条件的选择接近最佳,同时挑取的菌体不宜太多,否则会有非特异性扩增。
2. 使用的引物浓度不能太高,浓度过高会导致非特异性扩增,反应的循环数也不能太多,一般不超过25个。同时因为扩增的片段的GC含量问题,有的GC含量很低,有的又很高,导致菌落PCR不容易扩增出目的条带,在此建议在设置PCR程序时以高GC的温度为上限,每一循环降0.2度左右。
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