4. 温度循环完成后,进行琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物的保真性和得率。1~5ul PCR产物中的 DNA 片段可以在琼脂糖凝胶电泳中被溴化乙锭染色而检测出来。已知浓度的对照 DNA 可以用作 PCR 产物大小和浓度的参照。
第 3 阶段:用 Pfu DNA 聚合酶抛光 PCR 产物的末端
为配合某些 DNA 聚合酶而进行的引物的优化设计在 PCR 中只能很少地增加平末端片段的数目。要绝对地避免使用传统的 Klenow 聚合酶来抛光末端,因为它还保持着相当高的外切酶活性。幸运的是,T4 和 PfuDNA 聚合酶没有任何的 DNA 外切酶活性或 Tdt 活性,因此可以在 PCR 后用它们来产生平末端(见图 28-4)(Hu1993;Costa and Weiner1994c,d)。
PCR 抛光是用 DNA 聚合酶除去所有 PCR 产物的 3'端核苷酸延伸。产生的拋光分子在 T4DNA 连接酶的作用下可以以很高的效率和平末端克隆载体连接。在连接前拋光 PCR 产物的末端能够提高整个重组克隆的效率(Costa and Weiner1994c,d;Weiner et al.1994)。
低于 50°C 时 Pfu DNA 聚合酶基本上没有活性。这就可以让连接反应在 4~25°C 进行,而且在 72°C Pfu 拋光步骤后直接进入连接反应。这就不需要在连接反应前抽提酶,而用 T4 DNA 聚合酶拋光时就需要在连接反应前抽提酶。只要用少量的 PCR 产物,Pfu 拋光只需 30 min 就可以产生高保真的平末端 DNA 片段。下面略述了 Pfu 抛光的大概步骤,在 PCR 后可以直接进行 Pfu 抛光或者在 PCR 产物纯化后进行。