自己设计了一个引物转录后测试温度梯度的时候,用了之前提取的癌细胞cDNA,30个循环后条带非常亮。 然后选择了最亮的59度Tm,用正常细胞的cDNA来跑PCR,相同的反应条件下,30个循环条带很不明显 做到35个循环时,六个样本的条带出了五个,但只有一个比较清晰,另外四个要仔细才能看得见 请问:在这种情况下,要继续加循环数目提高么 另外像这种分子表达量比较低的情况下,做western会不会不容易出条带(蛋白浓度估计也不高)?
一般循环可以加到40个的,可能有突变,不过又不用测序
1、你之前提取的是癌细胞的cDNA,摸索出来的条件又以正常细胞cDNA为模板做PCR,这个有可适用性吗?模板都变了。为何不以正常cDNA为模板,摸索条件,再选取最佳条件呢?如果正常cDNA实在不好提取或者比较贵重,那我个人认为,PCR成功的关键引物最重要,其他的Tm,还有循环数都不是最重要的,有必要check下你的引物设计是否过关。2、很多人做western都不容易出条带,有问题的原因各种各样,但做成功的理由总是类似的,不放过任何细节。一步一步扎扎实实地做。祝你成功。
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