1. 主要实验材料 (1)细胞来源:4周龄雄性Wistar或其他品系大鼠。 (2)清洗液:不含Ca2+、Mg2+的PBS,加入100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素。 (3)消化液:2mg/mL胶原酶溶液,DMEM培养液配制,并加入牛血清白蛋白20mg/mL。 (4)培养液A:DMEM培养液,添加10%胎牛血清、100U/mL青霉素、50μg/mL链霉素。 (5)培养液B:培养液A,添加33 μmol/L生物素、17μmol/L泛酸盐(pantothenate)。 (6)培养液C:DMEM/Ham F12(1:1,V/V)混合培养液,加人15mmol/L NaHCO3、15 mmol/L HEPES、33 μmol/L人生物素、17 μmol/L泛酸盐、100U/mL青霉素、50 μg/mL链霉素,pH 7.4。 (7)ITT培养液:培养液C,添加5 μg/mL胰岛素、10 μg/mL转铁蛋白、200 pmol/L 三碘甲腺原氨酸(T3)。 (8)筛网:孔径为25 μm的尼龙筛网。
2. 操作方法
A.取材 (1)4周龄雄性大鼠,乙醚麻醉后断头处死。
(2)无菌条件下从附睾周围切取脂肪垫,放入培养皿中,并尽量除去血管,清洗液冲洗3次。 B.分离细胞 (1)充分剪碎组织,放人消化液中,37℃水浴振荡消化40min。 (2)将消化液倒入加有培养液A的烧杯中,用吸管反复吹打,并用孔径25μm 的尼龙筛网过滤,收集滤液和未滤过的组织块。 (3)滤液1800r/rain离心5min,弃上清;加入培养液B,制成SV细胞悬液,暂存入4℃冰箱中。 (4)将未滤过的组织块重复处理一次,离心沉淀的SV细胞团用培养液B制成 SV细胞悬液。 (5)合并两次获得的SV细胞悬液,吸管吹打混匀;取少量SV细胞悬液,计数,并调节细胞密度。计数时不计入血细胞。
C.原代培养 (1)以104个/cm2的密度将细胞接种于加有培养液B的培养皿中,于37℃、5%CO2培养箱中培养12~24h。 (2)细胞贴壁后,培养液C清洗2次,后加人培养液C过渡培养1h。 (3)弃培养液C,PBS清洗2次。 (4)ITT培养液维持培养,每3天换液一次。
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