标签: 病毒 病毒学检验第一篇第二章
病毒的鸡胚培养可用于:(1)某些病毒分离、增殖;(2)病毒的毒力测定、中和试验;(3)生产疫苗等。
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羊膜腔接种主要应用于从临床材料(如患者咳嗽液等)分离流感病毒等。这种接种途径可直接感染羊膜腔的内胚层,也可被鸡胚咽下或吸入,引起全胚胎感染。另外,病毒也可被排泄到尿囊腔中,使尿囊腔中含有大量病毒。因此,在用羊膜腔接种分离病毒时,除可收获羊水以外,还可收获尿囊液。
1. 接种步骤与方法
(1) 将 10~12 日龄的鸡胚在检卵灯上照视,划出气室范围,并在胚胎最靠近卵壳的一侧做记号。
(2) 用 2.5%碘酒及 75% 的酒精分别消毒气室部位的蛋壳,并用开孔器在气室顶端钻出一约10 mmX6 mm 的长方形裂痕,注意勿钻破壳膜。
(3) 用 2. 5%碘酒再次消毒钻孔区后,用灭菌的眼科小镊子除去长方形卵壳和外层壳膜,并滴加灭菌液体石蜡一滴于下层壳膜上,使其透明,以便观察胚胎的位置。
(4) 将注射器刺向胚胎的腭下胸前,以针头拨动下颚及腿,当进入羊膜腔内时,可看到鸡胚随针头的拨动而动,此时可注入0. 1-0. 2 ml 病毒液。
(5) 拔出针头,孔区用 2. 5%碘酒消毒,然后用沾有碘酒通过火焰的小块胶布将卵壳的小窗口封住,并于 33---35℃孵卵器内孵育 48-72 h比此过程要保持鸡胚的钝端朝上。
2. 解剖与收获
(1) 收获前鸡胚须置 4℃冰箱 6h 或过夜,但不能放置时间过长(过长会引起散黄)。如急于收获亦可置- 20℃ 冰箱1 h 左右。预冷的目的是,将鸡胚冻死,使血液凝固,避免收获时流出红细胞,并同尿囊液的病毒发生凝集,造成病毒滴度下降。
(Z) 用 2. 5%碘酒和 75%酒精分别消毒气室处的卵壳,并用灭菌剪刀剪去气室部的卵壳,此时勿使其碎片落于未损伤的壳膜上。用无菌毛细吸管吸取尿囊液,然后左手持小镊子夹起羊膜成伞状,右手用毛细吸管插入羊膜腔吸取羊水,平均每胚可收获 0. 5~1. 0 ml 羊水。
(3) 病毒通过胚胎机体后被排泄人尿囊腔,因此当羊水过少时,可用同胚少量尿囊液冲洗羊膜腔并吸取该洗液。
1. 防止污染。为了减少污染的危险,整个过程均需无菌操作,否则鸡胚一经污染,即迅速死亡或影响病毒的培养。
2. 适宜的培养温度。接种过的鸡胚,应根据实验病原繁殖需要的温度,放入 33-37°C 温箱内培养。
绒毛尿囊膜接种常用于牛痘病毒、天花病毒、单纯疱疹病毒的分离,因为这些病毒在绒毛尿囊膜上可形成肉眼可见的斑点状或痘疱状病灶。另外,病毒可在绒毛尿囊膜上进行滴定,因为感染性病毒颗粒的数目可以通过产生的斑和痘的数目来计算。该方法还可用于抗病毒血清的滴定试验,即在有抗体存在的情况下,痘疱形成受到抑制。
(1) 将孵育 10~13 日龄的鸡胚放在检卵灯上,用铅笔划出气室、胎位,并于与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育较好的卵壳上划一等边三角形,每边 10 mm 。
(2) 用碘酒消毒气室顶端及绒毛尿囊膜记号处,并用开孔器在记号处的卵壳上开一三角形裂痕,不可弄破下面的壳膜,同时在气室顶端钻一小孔。
(3) 用小摄子轻轻揭去所开小窗处的卵壳,露出壳下的壳膜,在壳膜上滴一滴生理盐水,用针尖循卵壳膜纤维方向小心地划破一隙,但注意切勿伤及紧贴在下面的绒毛尿囊膜。
(4) 用针尖刺破气室小孔处的壳膜,再用橡皮乳头紧按气室小孔向外吸气,造成负压,此时盐水小滴即可自裂隙流至绒毛尿囊膜上,从而使绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室。
(5) 用注射器通过卵壳的窗口滴 0. 05~0. 1 ml 病毒液于绒毛尿囊膜上,然后将鸡胚轻轻地旋转使接种物扩散到人工气室之下的整个绒毛膜尿囊膜上。
(6) 在卵壳的窗口周围涂上半凝固的石蜡,作成堤状,立即用消毒胶布封口。也可用揭下的卵壳封口,即将卵壳盖上,接缝处涂以石蜡,但石蜡不能过热,以免流人卵内。将鸡胚始终保持人工气室在上方的位置, 33~35℃继续培养 48~72 h 。
(1) 用 2. 5% 的碘酒和 75% 的酒精分别消毒人工气室上的卵壳,去除窗孔上的胶布。
(2) 将灭菌剪子插入窗内,沿人工气室的界限剪去卵壳及壳膜,露出绒毛尿囊膜,再用灭菌眼科摄子将膜正中夹起,用剪刀沿人工气室边缘将膜剪下,放人加有灭菌生理盐水的培养皿内,观察病灶形状或用于传代,或用 50%甘油保存。同时作无菌培养。
尿囊腔接种法广泛应用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的适应和传代培养,这些病毒被注射到尿囊腔后,可在内皮细胞中复制,复制的病毒被释放到尿囊液中,因此,在尿囊液中含有大量的病毒。
(1) 取 9~11 日龄的鸡胚,在检卵灯上照视后,用铅笔划出气室与胚胎位置,并在胚胎面与气室交界之边缘上约 1 mm 处避开血管作一标记,此即为注射点。
(2) 将鸡胚竖放在卵杯上,钝端向上。用 2.5%碘酒及 75%酒精分别消毒气室部的蛋壳,并用开孔器钻开一长约 2 mm 小口,此操作勿损伤壳膜。
(3) 再次用 2. 5%碘酒消毒钻孔区,以擦去蛋壳碎粒,并用1 ml 注射器吸取待接种的病毒液 0. 1~0. 2 ml, 将针头刺入孔内,经尿囊膜入尿囊腔,注入病毒液。
(4) 用 2. 5%碘酒消毒后,再用石蜡溶化封孔,于 33-35℃孵卵器孵育 48~72 h(培育时间应根据病毒种类及收获的材料何时使用而定),每日照检,于接种后 24 h 内死亡者为非特异性死胚应弃去。
2. 解剖与收获 接种后收获病毒的时间根据不同病毒而异,甲型流感病毒一般培养 44~48 h,乙型流感病毒培养 72 h 。
(1) 收获前鸡胚须置 4℃冰箱 6 h 或过夜,但不能放置时间过长。
(2) 用 2. 5%碘酒和 75%酒精消毒气室处的卵壳,并用灭菌剪刀剪去气室部的卵壳,此时勿使其碎片落于未损伤的壳膜上。用无菌镊子撕去气室部壳膜,并翻开到卵壳边上。
(3) 将鸡卵倾向胚胎一侧,用灭菌毛细吸管通过绒毛尿囊膜进入尿囊腔,吸出尿囊液。一般一个鸡胚可收获 5~10 ml 的尿囊液。若操作时损伤了血管,则病毒会吸附在红细胞上,尿囊液则无用。收获的尿囊液经无菌试验后,可在 4℃或低温保存待用。
(1) 取 5-8 日龄鸡胚(此时期卵黄囊大,易接种,且有较大的表面积供病原体繁殖),于检卵灯上划出气室和胚胎位置,垂直放置在卵架上,钝端朝上,并用 2. 5%碘酒和 75% 酒精消毒气室端。
(2) 用开孔器在气室中央的卵壳上钻一小孔,勿损伤壳膜,用带有 6 号针头的 1 ml 注射器将样品从小孔处沿胚的纵轴迅速刺入约 3 cm, 注入 0. 2-0. 5 ml 待接种的病毒于卵黄囊内, 随后用胶带或溶化的石蜡封孔。
(3) 置孵化箱内继续孵育 3-8 d,时间长短应根据病毒或立克次体的种类而定,每天翻卵 2 次,弃掉 24 h 内死亡的鸡胚(但东方型和西方型马脑炎可能在接种后 15-24 h 内死亡)。
(1) 收获时,鸡卵预冷,用 2.5% 的碘酒和 75%酒精消毒气室端的卵壳,用剪子去掉气室上的卵壳,除去壳膜后,用镊子将卵黄囊与绒毛尿囊膜分开。
(2) 取一把灭菌镊子夹出卵黄囊(黄色容易辨认)放在灭菌平皿中,必要时用生理盐水冲去卵黄。也可将全部内容物倾入平皿中,然后剥出卵黄囊。
(3)将不带卵黄的膜放在无菌平皿或烧杯中,以便用于染色检查或进行传代。对某些病毒的
分离则要收集全部胚体。
分不出病毒的原因
我用SPF鸡胚培养病毒,结果老是分不出来,这是什么原因?楼主能不能帮我分析一下,感激不尽。
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