标签: RAPD DNA 随机扩增 PCR
聚合酶链式反应(PCR)以其优越性极大地影响到了分子生物学的几乎所有领域,并以其基本程序和DGGE,开发出多种检测核苷酸变异的方法。RAPD(RandomAmplifedPolymorphicDNA)是其中一种,可用于(1)遗传图谱的构建(2)系统学研究(3)目的基因的标记和定位(4)纯度和外源基因的检测。
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1. 扩增偏差或无扩增。
(1)在部分或全部管中缺少一个组分。重复少量几个反应以确定所有的PCR组分是否都已加入。
(2)PCR抑制物可能与DNA一起纯化,改变DNA的浓度。
(3)在DNA分离中加入一个清洗步骤(如苯酚抽提)。
(4)稀释新的DNA溶液。
(5)引物母液失效。重新配制母液,使用不同的引物或提高引物浓度。
(6)延长退火时间(在PCR程序中的第二部分),或降低升温转换步骤之间的速率。
(7)提高每个反应中的Taq聚合酶的浓度。
(8)补加新的组分,该灭菌的都高压灭菌。
2. 扩增结果差,条带模糊或难以辨认。
(1)更换Taq聚合酶缓冲液。
(2)检查引物(使用另外一个引物,或者将引物末端标记,在16% 6 mol/L尿素聚丙烯酰胺胶上电泳检测)。
(3)检查Taq聚合酶活性(与不同批量的酶作比较)。
(4)改变DNA浓度。
3. 高相对分子质量产物弥散状分布>4 kb。
(1)降低DNA浓度。
(2)降低Taq聚合酶浓度。
(3)减少凝胶上样量。
(4)可能是由于循环数过多的结果(Bell和Demarini 1991),减少循环数。
(5)确认是否使用正确的缓冲液(不是水!)制备凝胶。
(6)在较低的电压下电泳。
4. 对照和所有检测样品中均为一条很强的单一带。
确认引物序列不是回文结构。这可能是引物多聚体造成的结果。使用不同的引物。
5. 带谱不可重复。
DNA过多或过少。把基因组DNA浓度控制在10~100 ng范围之内,DNA量太少时,“真正”靶序列与引物的结合效率低,因此引物扩增会产生假的条带,这就称为引物伪迹;DNA量太多会导致错误配对(指引物与基因组DNA的配对)。每个样品进行两个不同DNA浓度的反应。只考虑主要条带。
6. 染色后凝胶背景太强影响分辨率。
(1)减少染色时间。
(2)凝胶脱色时间延长。
(3)PCR反应中DNA含量或Taq聚合酶过多。
7. 低相对分子质量产物分离不充分。
在更高浓度的琼脂糖凝胶、专业纯凝胶或聚丙烯酰胺凝胶上分离产物。
1. RAPD主要有以下的自身特点:①无需专门设计RAPD扩增反应的引物,也无需预知被研究的生物基因组核苷酸顺序,引物是随机合成或是任意选定的。引物长度一般为9——10个寡核苷酸。②每个RAPD反应中,仅加单个引物,通过引物和模板DNA链随机配对实现扩增,扩增没有特异性。③退火温度较低,一般为36℃,这能保证短核苷酸引物与模板的稳定配对,同时也允许了适当的错误配对,以扩大引物在基因组DNA中配对的随机性。④较之常规PCR,RAPD反应易于程序化。利用一套随机引物,得到大量DNA分子标记,可以借助计算机进行系统分析。
2. RAPD分析的优越性和不足,RAPD是一种全新且有效的遗传标记,与其他分子标记相比,具有许多优越之处:①合成一套引物,可用于不同生物基因组的分析。相对来说,RFLP标记具种族特异性,这限制了其应用。②RAPD技术简便易行,省力省时。不需要RFLP分析的预备工作,如克隆制备、同位素标记、Southern印迹和分子杂交。并且RAPD检测灵敏方便,用荧光染料或同位素标记均可检测,这大大增加了其分析速度。即使用序列胶来分析RAPD,单独一人仅用36小时便能完成120个样品的分析,而RFLP至少要花一周时间。③RAPD分析所需样品DNA量极少。仅为RFLP的1/1000-1/200,这对于生物早期取样鉴定或DNA受限制的情况大有益处。④由于RAPD用于构建基因图谱时不需要克隆,这可打破克隆载体和宿主的限制,扩大了应用范围。⑤每个RAPD标记相当于基因组分析中的靶序列位点,这对共同协作的研究项目,可简化信息的转移过程。⑥RAPD标记可以对那些RFLP难以区分的基因组区域作出遗传连锁图。⑦RAPD分析能自动化,减少了象RFLP那样的麻烦手续。
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