一、材料 无菌 1. 基础培养液:DMEM 和 F12 混合液 50:50 2. FBS(Sterile Systems, Hyclone) 3. 完全培养液:DMEM 和 F12 混合液,添加 10%FBS 4. BSS 5. 0.1% 胶原蛋白酶(IV 型,Worthington)和 0.1% 胰蛋白酶(1:250,Sigma)混合液,用 0.15mol/L NaCl 配制 6. 0.5 mg/ml DNase,用生理盐水配制 7. 胰蛋白酶和 EDTA 混合液:用 0.1% 胰蛋白酶(1:250)和 1 mm/L EDTA(培养基,Sigma)配制 8. 手术刀和组织镊 9. 孔径为 160um 的 Nitex 滤网(Tetko) 10. 培养皿和培养瓶 11. 50 ml 试管 非灭菌 1. 有轨振荡器(Bellco) 二、操作步骤 消化组织 1. 按冠状面将肾切成 5~10 mm 厚的组织片。用冰冷的基础培养液洗组织片。 2. 从皮质的外层切下组织,然后用十字刀片切成 1~2 mm 小块。 3. 将约 5 ml 组织块放入盛有预热的 20 ml 胶原蛋白酶和胰蛋白酶混合液的 50 ml 试管。 4. 轻轻摇晃,孵育组织块 1 h。 5. 吸除消化液,然后加入新鲜消化液。 6. 每隔 20 min 收集细胞悬液,然后加入 20 ml 含有 0.5 mg/ml DNase 的培养基础液,用 10 ml 吸管轻轻研磨 10 转。 7. 用等量的完全培养液稀释收集的细胞悬液。将稀释后的细胞悬液置于冰上。 8. 重复收集步骤 5 次或 5 次以上,直至组织块被完全分散。 9. 将收集的细胞悬液混合,分装如 50 ml 试管, 10. 离心(100 g,15 min)后,用 45 ml 含 DNase 的完全培养液混悬细胞。 11. 用孔径为 160um 的 Nitex 滤网过滤细胞悬液。 12. 这种分离方法既分离到系抱团,又分离到单个细胞,故细胞计数不可靠。每个 75cm2培养瓶内放 15 ml 细胞悬液,细胞扩增后传代培养或冻存。 |