标签: 3H-胸腺嘧啶脱氧核苷标记指数实验
细胞培养至适当密度,用1H-胸腺嘧啶脱氧核苷标记30min,清洗后固定细胞,除去未掺入的前体物,准备同位素放射自显术。 来源:动物细胞培养:基础技术指南第五版
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材料 无菌 培养细胞 生长液 0.25% 粗制胰蛋白酶 D-PBSA 3H-胸腺嘧啶脱氧核苷,2.0MBq/ml (约 50uCi/ml),75 GBq/mmol (约 2Ci/mmol) 安全提示 处理 3H-胸腺嘧啶脱氧核苷时要谨慎, 因为它是放射活性物质和基因产物!要遵照当地指南操作(见 7.7 节)。 多孔培养板,内含 13 mmThermanox 盖片(Nalge Nunc) 非无菌 血球计数板或电子计数器 D-PBSA 醋酸甲醇(1 份冰醋酸加入 3 份甲醇),冰冷,新鲜配制 显微镜载片 封胶(如 DPX 或 Permount) 三氯乙酸(TCA ),0.6mol/L ,冰冷 去离子水 甲醇 操作步骤 1. 在装有盖片的 24 孔培养板中,以 2X104~5X104 个/ml 培养细胞。 2. 待细胞贴壁,开始增殖(48~72 h) , 让其达到所需要的细胞密度。 3. 在培养液中加入 3H -胸腺嘧啶脱氧核苷,100KBq/ml(约 5uCi/ml),将细胞继续培养 30 min 。 提示 某些培养基,例如 Ham’s F10 和 F12,它们含有胸腺嘧啶脱氧核苷 (表 9.3,10.1 和 10.2),那么放射活性的胸腺嘧啶脱氧核苷的浓度要增加,这样方能在培养液内达到相同的特异活性。 4. 除去标记液体,将它弃于专用的放射废物容器中。 5. 用 D-PBSA 清洗盖片 3 次。每冲洗一次,要从孔底部揭起盖片(但不要超出该孔),以便使盖片底部的同位素能冲掉。 6. 加人 1:1 的 D-PBSA : 醋酸甲醇,每孔 lml,然后立即吸去。 7. 每孔加人 lml 冰醋酸(4℃ ),静止 l0 min。 8. 取出盖片,用风扇吹干。 9. 将盖片封固于显微镜载片上,细胞面朝上。 10. 让封固胶过夜干燥。 11. 将载片放在含 0.6mol/L TCA 的染色缸中(4°C),静置 lO min,在此过程中更换 2 次 TCA,借此可除去未掺人的前体物。 12. 用去离子水淋洗,然后改用甲醇,晾干。 13. 准备放射自显术(见方案 27.3. )。 14. 当放射自显影进行一段曝光时间(通常 1~2 个星期),显影,染色(见方案 27.3),40 倍显微镜下观察。 15. 计数标记细胞的百分比。为了涵盖代表区,按图 21.14 所示进行扫描观察。
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