材料 无菌 生长培养基:含高浓度葡萄糖(4.5 g/L)的 Dulbecco's modifiled Eagle's 培养液(DMEM),添加 L-谷酰胺 2 mmol/L、10% 胎牛血清、100U/mL 青霉素及 100 ug/mL 链霉素 聚凝胺: 8 mg/mL 普通容器 :培养瓶 25 cm2,75 cm2 反转录酶病毒载体的产生用材料 细胞系: PG13 GP+E-86 反转录病毒载体 GCsam hTERT 转染用 htrt DNA Tx 缓冲液 :总量 20 mL,含有以下物质: HEPES 0.5mol/L,pH 7.1 200uL NaCl,5rnol/L 100uL Na2 HPO4/NaH2PO4,1mol/L 3uL UPW 1.7 mL 缓冲液 A:总量 20.04 mL,含有以下物质: NaCl(5mol/L) 600uL EDTA(0.5mol/L)40uL Tris-HCl,pH7.5(0.5mol/L)400uL UPW 19 mL hMSC(人间充质干细胞)细胞的转导用材料 hMSC(人间充质干细胞)细胞 培养瓶 75 cm2 多孔板 6 孔 转导后用材料 用于冷冻保存的实验材料(见方案 20.1) 用于 DNA 指纹分析 (见方案 16.8) 或 DNA 图谱分析(见方案 16.9)或其他验证分析方法的实验材料(如方案 16.10) PCR 试剂 DNA 100 ug/mL 10x PCR 缓冲液 L(含 Mg2+) 正向引物(2umol/L) 反义引物(2umol/L) dNTP 混合物(10 mmol/L) DNA 聚合酶 UPW 操作步骤 反转录酶病毒载体的产生 具有 hTERT 基因的反转录酶病毒载体通过两个步骤包装进入长臂猿白血病病毒(GALV)包装的细胞系 PG13。首先,使用 20 ug/mL htrtDNA(Geron)转染包装细胞系 GP+E-86,然后用上清液感染 PG13 细胞。 1. 6.7x105 GP+E-86 细胞系接种在一个小培养瓶(25 cm2)中。 2.GP+E-86 细胞系的转染 (a)将 280uL Tx 缓冲液加人每个管中(常用容器)。 (b)制备 DNA 管: 组成名称 DNA 浓度 15 ug DNA 缓冲液 A CaCl2 2.5mol/L 总量 Z*ug/uL X*uL 280-30-X 30 280
* X x Z = 15 ug (c)将 Tx 缓冲液逐滴加人含有 DNA 溶液的管内,轻轻地混合。 (d)在室温下孵育 30℃,使其产生沉淀。 (e)在每个含有 GP-E-86 细胞的 25 cm2 培养瓶中,加入 5 mL 新鲜培养液。 (f)轻轻加入混合液(Tx+DNA)至 GP+E-86 细胞,在 37℃ 孵育 4-6 h。 (g)在 25 cm2 培养瓶内,用 D-PBSA 小心地洗三次。 (h)加新鲜培养液至细胞中,在 37℃ 孵育过夜。 3. 更换细胞培养液,加 2 mL 新鲜培养液 (取代以前 5 mL 培养液),以产生病毒。 4. 在进行第三步的同一天,将 1x104个 PG13 细胞接种于 6 孔板的每个孔中。
5. 次日,从感染的 GP-E-86 细胞收获其上清液,加入最终浓度为 8 ug/mL 的多聚胺 (如 1 ug/mL 上清液)。 6. 用孔径 0.45 um 滤膜过滤上清液,将 2 mL 过滤液加至含 GP-E-86 细胞的每个孔中。 7. 在 32℃ 1000 g 离心培养板。 8. 在 37℃ 孵育过夜。 9. 次日,更换细胞的培养液。 hMSC 细胞的转导 1. 将 2x106 PG13 细胞种人 75 cm2 培养瓶中。
2. 次日,将 6 mL 新鲜培养液加至 PG13 细胞中。 3. 第三日,将 hMSC 细胞(约 2.5x104~7.5x104 个)加至 6 孔板中,用于转导。
4. 从包装的细胞收获上清液,加入最终浓度为 8 ug/mL 的多聚胺,用孔径 0.45 um 的滤膜过滤上清液。 5. 将 2 mL 过滤后的反转录病毒上清液加入 6 孔板的每个孔中。 6. 在 32℃ 1000 g 离心培养板,37℃ 孵育过夜。 7. 吸去逆转录病毒上清液,加入新鲜培养基。 转导后培养物的处理 1. 经过 10~12 次传代接种,未接受 hTERT 基因的细胞将死亡,剩余的细胞 则肯定已插入 hTERT 基因,具有 hTERT 基因的细胞将在传代过程中被选择出来。 2. 建议将细胞分装在安瓿中冷冻保存,建立一个转导细胞的贮备库,这些转导细胞处于不同的群体倍增(PI)水平(可与 PD 生长曲线相匹配)。这样做也可节省时间,因为如果发生污染就要丢弃培养的细胞,重新开始。 3. 在梅次传代培养时,用下列公式获得 PD,以建立 PD 生长曲线。 公式中的 PD 代表种群倍增的次数,In 是自然对数 Nstart 是细胞初始接种量,Nfinish 是细胞在传代培养过程中所获得的全部细胞数。 例 1,如果最初种入 2x105个细胞,培养后增加至 3.2x106个细胞,则: 如果按 1:4 的细胞量进行传代培养,则每次传代培养后的 Nfinish 将乘以 4。所以在上述例子中,假设有 10 次传代培养,Nfinish 就是(3.2x106)x4 的 10 倍,也就是 3.4x1012。
例 2,如果最初种入 2x105 个细胞,培养后可增加至 3.2x106个细胞。以 1:4 的细胞址传代培养 10 次,则:
4. 在建立永生细胞系之后,必须检查其真实性,以确保其来源于最初的材料, 而不是由于交叉污染从实验室其他永生细胞系衍生而来(见 19.5 节)。这是能做到的,例如针对转移基因(hTERT)(见下)的 PCR 检测、DNA 指纹检 测(见方案 16. 8)或 DNA 图谱检测(见方案 16.9)。 hTERT 的 PCR 1. 溶解 PCR 试剂并保存在冰块中 2. 对下列试剂进行仔细的混合,记住,一定要包括阳性对照(其他 hTERT 阳 性标本)和阴性对照(无 DNA 模板) DNA1uL(100ng) 100 ug/mL 10xPCR 缓冲液(含Mg2+) 2uL
正义引物 2uL 反义引物 2uL dNTP 混合物(10 mmol/L) 0.4uL DNA 多聚酶 0.1uL UPW 12.5uL 最终体积为 20 mL(包括 DNA)
3. 将管子置于 PCR 仪器中,按以下步骤进行操作:90℃,3 min,首先进行变性作用;94℃,30s,再次进行变性作用;59℃,39s,进行复性;74 ℃,1 min,进行延伸;如此循环 30 个周期,然后是 74℃,1 min。 4. 将 PCR 产物在 1.5%~2% 琼脂糖凝胶中进行电泳。 |